新型双靶向嵌合体：实体瘤免疫治疗的新突破，精准狙击肿瘤浸润 Treg 细胞

研究背景

在癌症免疫治疗中，肿瘤浸润 Treg 细胞是导致免疫逃逸的关键 “帮凶”，其高表达 PD-L1 和 CD47 等免疫检查点分子，既抑制效应 T 细胞活性，又通过 “别吃我” 信号逃避巨噬细胞吞噬。CD47 阻断在血液肿瘤中已显疗效，但实体瘤中面临抗原沉陷效应和肿瘤选择性不足的难题;而系统性抑制免疫检查点常伴随严重的脱靶毒性。因此，开发兼具肿瘤特异性和双靶点抑制功能的治疗工具，成为突破实体瘤治疗瓶颈的关键。

来自香港浸会大学中医药学院表型组学研究中心、整合生物信息学与转化科学研究所、粤港澳大湾区适配体转化医学与药物研发国际研究平台，以及英国伯明翰大学医学院的团队在《Molecular Biomedicine》上发表题为Targeting tumor‑infiltrating regulatory T cells: combining CD47 and PD‑L1 inhibition via a novel aptamer‑siRNA chimera的文章，研发了一种新型 PD-L1 适配体 - CD47 siRNA 嵌合体，通过双靶向抑制 PD-L1 和 CD47 信号，选择性耗尽肿瘤浸润调节性 T 细胞(Treg)，在小鼠肝癌模型中显著抑制肿瘤生长并延长生存期，为实体瘤免疫治疗提供了非抗体类新策略。

实验方法

1.PD-L1 适配体 - CD47 siRNA 嵌合体的设计与合成：采用内部 C3 间隔子将团队前期开发的 PD-L1 特异性适配体与 CD47 siRNA 偶联，构建 Cy5 标记的双功能嵌合体，通过酶联寡核苷酸 assay(ELONA)验证其与 PD-L1 蛋白的结合亲和力。

2.体外细胞实验验证靶向性与功能：分离小鼠肝癌模型中的肿瘤浸润 Treg 细胞，通过流式细胞术、共聚焦显微镜检测嵌合体的结合特异性、细胞摄取效率及内吞途径;采用 qPCR 和 Western blot 验证 CD47 沉默效果，Transwell 实验评估 Treg 细胞迁移能力。

3.体内动物实验评估抑瘤效果：构建 C57BL/6J 小鼠皮下 Hepa1-6 肝癌模型，从接种后第 7 天起每 3 天静脉注射嵌合体(2mg/kg)，持续至第 29 天，监测肿瘤生长曲线、重量及小鼠生存期;通过 H&E 染色、Ki67 和 TUNEL 染色分析肿瘤增殖与凋亡。

4.免疫微环境与机制分析：采用流式细胞术检测肿瘤组织中 Treg、CD8⁺T 细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量与功能;通过 Seahorse 分析仪检测糖酵解速率(ECAR)和氧消耗速率(OCR)，结合 Western blot 分析代谢相关信号通路(pERK1/2、pRac1 等)。

5.安全性与代谢组学评估：检测小鼠红细胞计数、肝肾功能指标(AST、ALT、BUN 等)评估生物安全性;通过液相色谱 - 质谱联用(LC-MS)分析血清氨基酸代谢谱，探究嵌合体对代谢通路的调控作用。

关键结果

图1：嵌合体的合成表征与靶向细胞结合功能

该 PD-L1 适配体 - CD47 siRNA 嵌合体通过 C3 间隔子成功偶联，与 PD-L1 蛋白的结合亲和力维持在纳摩尔水平(Kd=174nM)，虽略低于单独适配体但能避免脱靶结合。流式细胞术和共聚焦结果显示，嵌合体可特异性结合 PD-L1 高表达的肿瘤浸润 Treg 细胞，对 PD-L1 低表达细胞及经抗 PD-L1 抗体封闭的细胞结合能力极弱;其细胞摄取效率与游离适配体相当，显著高于游离 siRNA，且主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。qPCR 和流式验证表明，嵌合体可高效沉默 Treg 细胞的 CD47 表达，同时显著抑制 Treg 细胞向 IP10(肝肿瘤微环境关键趋化因子)的迁移。

图2：嵌合体的肿瘤靶向特异性与体内安全性

体内生物分布分析显示，嵌合体在肿瘤浸润 Treg 细胞中富集程度显著高于脾脏 Treg 细胞和外周血单个核细胞(PBMC)，且对肝、肾、肺等主要器官无明显蓄积。安全性评估表明，嵌合体处理组小鼠的红细胞计数与对照组无差异，而单独 siRNA 组出现轻微下降;肝肾功能指标(AST、ALT、BUN、肌酐)均在正常范围，且小鼠体重稳定，无明显系统毒性。MTT 实验显示嵌合体对肿瘤浸润 Treg 细胞的半数抑制浓度(IC50)为 98.04nM，具备强效靶向杀伤能力。

图3：嵌合体显著抑制肝癌生长并阻断血管生成

在小鼠肝癌模型中，嵌合体治疗组的肿瘤体积和重量显著小于 PBS 组、单独适配体组及单独 siRNA 组，肿瘤抑制率大幅提升;Kaplan-Meier 生存分析显示，嵌合体处理组小鼠生存期显著延长。组织学分析表明，嵌合体可减少肿瘤组织中 Ki67 阳性增殖细胞数量，增加 TUNEL 阳性凋亡细胞比例;Western blot 和免疫荧光结果显示，肿瘤组织中 VEGF、MMP-3、ANG-1 等血管生成关键分子的表达显著降低，且 VEGF 与 ANG-1 的共定位明显减少，表明血管生成过程受到有效抑制。

图4：嵌合体选择性耗尽 Treg 细胞并增强抗肿瘤免疫浸润

流式细胞术分析显示，嵌合体治疗后肿瘤组织中 FoxP3⁺CD4⁺Treg 细胞的频率和绝对数量显著减少，但总 CD4⁺T 细胞数量无明显变化，且 Th17 细胞(IL-17A⁺CD4⁺)比例代偿性增加。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和极化状态(CD80⁺M1/CD206⁺M2)无明显改变，但巨噬细胞的吞噬活性显著增强;同时，肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞的数量显著增加，且 IFN-γ、颗粒酶 B、CD69 等效应分子和激活标志物的表达上调，提示效应 T 细胞功能增强。免疫组化和荧光染色进一步验证了 Treg 细胞浸润减少和 Th17 细胞浸润增加的表型。

图5：嵌合体诱导 Treg 细胞代谢重编程与凋亡

Seahorse 分析显示，嵌合体处理后 Treg 细胞的糖酵解速率(ECAR)显著降低，线粒体呼吸速率(OCR)和脂肪酸氧化(FAO)活性升高，伴随细胞内脂质滴积累和线粒体活性氧(ROS)水平增加。共聚焦和 Western blot 结果表明，Treg 细胞中葡萄糖转运蛋白 Glut1 和葡萄糖激酶(GCK)的表达下调，糖酵解相关蛋白(PFKFB3、p-ERK1/2、p-Rac1)表达降低;同时，Cyclin D1、Bcl-2、NF-κB 等存活相关分子表达减少，活性 caspase-3 表达增加，提示 Treg 细胞发生凋亡。CD47 过表达可逆转上述代谢和凋亡表型，证实 CD47 沉默是关键调控因素。

图6：嵌合体调控脯氨酸代谢通路影响肿瘤免疫微环境

代谢组学分析显示，嵌合体治疗后小鼠血清中天门冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸等氨基酸水平显著改变。KEGG 通路富集分析表明，精氨酸 - 脯氨酸代谢、缬氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸降解等通路被显著调控;疾病特征富集分析显示，这些代谢变化与脂质转移酶 1 缺乏症、二氢硫辛酰胺脱氢酶缺乏症等代谢疾病相关，其中脯氨酸作为核心代谢物，其水平降低可能通过重塑肿瘤微环境的免疫抑制表型，促进抗肿瘤免疫应答。

全文总结

该研究针对实体瘤免疫治疗中 CD47 阻断的局限性和系统性免疫检查点抑制的脱靶毒性，设计了一种新型 PD-L1 适配体 - CD47 siRNA 嵌合体，通过 PD-L1 介导的靶向递送实现对肿瘤浸润 Treg 细胞的精准识别，同时发挥 PD-L1 抑制和 CD47 沉默的协同作用，既破坏 Treg 细胞的免疫抑制功能，又通过代谢重编程(抑制糖酵解、增强脂肪酸氧化)和凋亡诱导耗尽 Treg 细胞，进而解除对 CD8⁺T 细胞和巨噬细胞的抑制，重塑抗肿瘤免疫微环境。在小鼠肝癌模型中，该嵌合体展现出显著的抑瘤效果和良好的生物安全性，为实体瘤免疫治疗提供了一种非抗体类、肿瘤特异性的新策略;但研究仍存在单一肿瘤模型的局限性，未来需在更多实体瘤模型中验证，并深入解析代谢重编程的上游调控机制，推动该 RNA 疗法向临床转化。