体视学定量分析肿瘤浸润免疫细胞：转移性黑色素瘤免疫治疗的预测新工具

研究背景

转移性黑色素瘤是一种侵袭性强的皮肤癌，免疫检查点抑制剂(ICIs)的出现彻底改变了其治疗格局，但仍有 37% 的患者在治疗初期失败，且超过 60% 接受联合 ICIs 治疗的患者会出现 3-4 级免疫相关不良事件(irAEs)。肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)是 ICIs 激活抗肿瘤免疫的核心，但目前缺乏精准、客观的量化方法来预测治疗效果和毒性风险。因此，开发可靠的 TIICs 定量技术及相关生物标志物，对优化黑色素瘤免疫治疗策略至关重要。

《Experimental and Molecular Pathology》上题为Stereological quantification of tumor infiltrating immune cells as predictor of immunotherapy in metastatic melanoma的文章，通过体视学定量分析转移性黑色素瘤患者的肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)，发现 PD-L1、CD8、CD1a 阳性细胞可预测免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗效果，CD3 和 PD-L1 阳性细胞可评估免疫相关不良事件(irAEs)风险，CD8 阳性细胞高浸润与患者更长生存期相关，为黑色素瘤免疫治疗个性化提供了新依据。

实验方法

1.患者样本与临床数据收集：回顾性纳入 28 例接受 ICIs(27 例纳武利尤单抗、1 例帕博利珠单抗)治疗的转移性黑色素瘤患者，收集福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的转移组织样本(淋巴结 13 例、皮肤 9 例、其他部位 6 例)，记录患者临床信息(治疗反应、irAEs 发生情况、无进展生存期 PFS、总生存期 OS)，并按治疗反应分为良好反应组(完全 / 部分缓解，12 例)、不良反应组(疾病进展，8 例)和稳定疾病组(7 例)，按 irAEs 发生情况分为阳性组(6 例)和阴性组(22 例)。

2.组织处理与免疫组化染色：样本经脱水、包埋后切成 5μm 切片，进行苏木精 - 伊红(HE)染色观察组织形态，同时使用 12 种特异性抗体(CD1a、CD1d、CD3、CD4、CD8 等)进行免疫组化染色，通过 DAB 显色和苏木精复染可视化目标免疫细胞及免疫检查点分子(PD1、PD-L1、LAG3)，设置阳性和阴性对照确保染色特异性。

3.体视学定量分析：使用 Stereologer 11 软件结合 Olympus BX41 显微镜，采用系统随机抽样法选择观察视野，通过体视学点格和 Cavalieri 原理，定量分析每种标志物阳性细胞的面积分数，评估时排除非肿瘤组织和坏死区域，操作人员对样本临床状态设盲，共分析约 33,000 个视野。

4.统计分析：采用 GraphPad Prism 10 软件进行统计分析，Mann-Whitney U 检验比较不同组间免疫细胞浸润差异;绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC)，评估标志物的预测价值;Spearman 相关分析探究标志物间相关性;Kaplan-Meier 法结合 Gehan-Breslow-Wilcoxon 检验分析免疫细胞浸润与患者生存期的关联，P≤0.05 为差异有统计学意义。

关键结果

图1：转移性黑色素瘤组织中 12 种免疫标志物的免疫组化表达

该图展示了 12 种目标标志物在转移性黑色素瘤组织中的典型染色结果，包括树突状细胞 / 朗格汉斯细胞(CD1a)、总 T 淋巴细胞(CD3)、细胞毒性 T 淋巴细胞(CD8)、B 淋巴细胞(CD20)、巨噬细胞(CD68)、调节性 T 细胞(FOXP3)及免疫检查点分子(PD1、PD-L1、LAG3)等。所有标志物均能清晰识别对应免疫细胞，阳性信号定位准确，为后续体视学定量提供了可靠的形态学基础，比例尺为 50μm，放大倍数 40×。

图2：转移性黑色素瘤的微观结构定量方法

该图呈现了体视学定量的完整流程：HE 染色显示黑色素瘤转移灶的整体形态及坏死边缘(图 2A，比例尺 2mm，20×);通过体视学点格结合 Cavalieri 原理评估阳性细胞分数(图 2B，比例尺 250μm，4×);系统自动选择等距视野确保抽样客观性(图 2C，比例尺 250μm，4×);通过探针框架定量 CD8 阳性细胞的面积分数(图 2D，比例尺 50μm，40×)。该方法可排除组织取向和观察者偏倚，实现免疫细胞的三维精准定量。

图3：淋巴结与皮肤转移灶中肿瘤浸润免疫细胞的差异

比较淋巴结转移灶(13 例)与皮肤转移灶(9 例)的免疫细胞浸润情况，发现所有 12 种标志物的阳性细胞面积分数均存在显著差异。其中 CD4、CD20、CD68、FOXP3、LAG3、PD-L1、PD-1 阳性细胞的差异极显著(P≤0.0001)，CD1a、CD8 阳性细胞差异显著(P≤0.001)，CD1d、CD3、CD56 阳性细胞差异有统计学意义(P≤0.05)，表明不同转移部位的肿瘤免疫微环境(TIME)具有独特的免疫细胞组成特征。

图4：淋巴结与皮肤转移灶中免疫标志物的相关性

淋巴结转移灶(图 4A)与皮肤转移灶(图 4B)的免疫标志物相关性存在差异，但部分关联具有一致性：CD4 与 CD8、CD4 与 FOXP3、LAG3 与 PD1 在两种转移灶中均呈显著正相关。独特相关性方面，皮肤转移灶中 CD8 与 PD-L1 呈强正相关(R=0.76，P<0.001)，而淋巴结转移灶中二者无显著关联，反映了不同转移部位免疫调控机制的异质性。

图5：PD-L1 阳性细胞浸润与 ICIs 治疗反应的关联

在所有转移灶亚型中，ICIs 治疗良好反应组(完全 + 部分缓解)的 PD-L1 阳性细胞浸润水平显著高于不良反应组(疾病进展)(P≤0.05，图 5A)。ROC 曲线分析显示，PD-L1 预测 ICIs 良好反应的曲线下面积(AUC)为 0.6597(图 5B)，证实 PD-L1 阳性细胞浸润是黑色素瘤 ICIs 治疗反应的有效预测指标。

图6：淋巴结转移灶中 CD1a、CD8、PD-L1 阳性细胞与 ICIs 治疗反应的关联

针对 9 例淋巴结转移灶患者的分析显示，良好反应组的 CD8 和 PD-L1 阳性细胞浸润显著更高(P≤0.05)，CD1a 阳性细胞浸润显著更低(P≤0.05)(图 6A)。ROC 曲线显示，三者预测治疗反应的 AUC 分别为 0.7535(CD1a)、0.7500(CD8)、0.7704(PD-L1)(图 6B)，提示在淋巴结转移灶中，这三种标志物联合可提高 ICIs 治疗反应的预测准确性。

图7：淋巴结转移灶中 CD1a、CD8、PD-L1 阳性细胞与疾病控制率的关联

将治疗反应扩展为疾病控制率(完全 + 部分缓解 + 稳定疾病)与不良反应(疾病进展)进行分析，结果与之前一致：淋巴结转移灶中 CD8 和 PD-L1 阳性细胞高浸润、CD1a 阳性细胞低浸润与更高的疾病控制率显著相关(P≤0.05，图 7A)，三者的 AUC 分别为 0.7321(CD1a)、0.7066(CD8)、0.7731(PD-L1)(图 7B)，进一步验证了这三种标志物的预测价值。

图8：CD8 阳性细胞浸润与患者生存期的关联

Kaplan-Meier 生存分析显示，CD8 阳性细胞浸润水平≥70 百分位的患者，无进展生存期(PFS)显著更长(中位未达到 vs 305 天，P=0.0166)，总生存期(OS)也显著延长(中位未达到 vs 431 天，P=0.0454)(图 8)。这表明 CD8 阳性细胞高浸润不仅是 ICIs 治疗反应的预测指标，也是转移性黑色素瘤患者的独立预后因素。

图9：CD3 和 PD-L1 阳性细胞浸润与 irAEs 的关联

在发生 irAEs 的患者中，转移灶组织的 CD3 和 PD-L1 阳性细胞浸润水平显著更低(CD3：P≤0.001;PD-L1：P≤0.05，图 9A)。ROC 曲线分析显示，CD3 预测 irAEs 的 AUC 为 0.7660，PD-L1 的 AUC 为 0.6515(图 9B)，提示 CD3 和 PD-L1 低浸润可作为 irAEs 风险的潜在预测指标。

全文总结

该研究通过体视学定量分析 28 例转移性黑色素瘤患者的肿瘤浸润免疫细胞，揭示了淋巴结与皮肤转移灶在免疫微环境组成上的显著差异，证实 PD-L1 高表达、CD8 高浸润及 CD1a 低浸润可有效预测 ICIs 治疗反应，CD3 和 PD-L1 低浸润与 irAEs 发生风险增加相关，且 CD8 阳性细胞高浸润与患者更长的无进展生存期和总生存期显著相关;体视学方法的应用减少了病理评估的主观性，提高了结果的可重复性，为转移性黑色素瘤患者的免疫治疗效果预测、毒性风险评估及预后判断提供了可靠的生物标志物组合和技术支撑，但研究存在样本量较小、回顾性设计等局限性，未来需大样本前瞻性研究进一步验证这些发现的临床转化价值。