最小扩增乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞的特性分析及其免疫治疗指导价值

乳腺癌是女性最常见癌症，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的过继细胞转移(ACT)是重要免疫治疗策略，但传统 TILs 扩增易引入偏倚。最小扩增 TILs(“年轻 TILs”)可保留原始表型和功能，但其在乳腺癌中的特性尚未明确。

《Frontiers in Immunology》上这篇题为Minimally expanded breast cancer tumor-infiltrating lymphocytes provide guidance for therapeutic selection的文章，建立低 IL-2 补充的最小扩增 TILs 培养方法，保留其肿瘤微环境中的原始特性;发现高 TIL 浸润区 CD4 + 与 CD8+ T 细胞共存，低浸润区 CD4+ T 细胞占优且与细胞毒性分子呈负相关;CD4+ TILs 具有更长 TRA CDR3 核苷酸序列、更短 TRB N (D) N 区域及更低 TCR 库多样性，CD8+ TILs 无显著 TCR 特征关联;该特性可指导免疫治疗中高治疗潜力 TILs 的筛选。

实验方法

1.TILs 最小扩增培养：将 11 例乳腺癌活检组织(4 例三阴性、3 例 Luminal A、4 例 Luminal B)切成小块，以含 100 U/mL IL-2 的完全培养基培养(2-4 个月)，每 5 天更换半量培养基并收集上清，最小化人工干预。

2.IHC 浸润程度评估：选取 5 例样本制作镜像切片，经 HE 染色和 CD3 抗体 IHC 检测，按标准分为高 / 低 TIL 浸润区，关联培养的 TILs 特性。

3.流式细胞术表型分析：收集培养 2-5×10⁵细胞，用 CD3、CD4、CD8 抗体染色，分析 CD3+ T 细胞中 CD4+、CD8 + 亚群比例及 CD8/CD4 比值。

4.细胞因子与 TCR 库分析：采用 LEGENDplex 试剂盒检测上清中 11 种分子(IL-4、IFN-γ、颗粒酶 A/B 等);提取 7-15 天培养细胞的 RNA，通过 SMARTer TCR 测序试剂盒构建文库，MiSeq 测序后分析 TCRα/β 链 CDR3 特征及多样性。

5.统计分析：用 GraphPad Prism 7 进行统计，Spearman/Pearson 相关性分析，rarefaction 曲线评估 TCR 库丰富度，归一化香农 - 维纳指数(nS-W)衡量多样性。

关键结果

图.1 IHC 浸润程度与 TIL 亚群组成关联

该图验证了最小扩增 TILs 与肿瘤原始浸润特征的一致性。(A、B)代表性活检样本的 IHC 镜像切片与肿瘤组织实物，IHC 用于划分高 / 低浸润区;(C)高浸润区 CD3+ T 细胞比例显著高于低浸润区(p<0.05);(D)高低浸润区 CD8/CD4 比值无显著差异;(E、F)CD4+ T 细胞比例在高(p<0.05)、低(p<0.01)浸润区均显著高于 CD8+ T 细胞，低浸润区 CD4 + 优势更明显。

图.2 CD3 + 比例与 CD8/CD4 比值的相关性

该图揭示 TIL 亚群比例的动态关联。(A)首次检测时间点，CD3 + 比例与 log10 转化后的 CD8/CD4 比值无显著相关性(Spearman r=-0.06，p=0.672)，但呈微弱负向趋势;(B)所有时间点合并分析，二者呈弱但显著的负相关(Spearman r=-0.169，p=0.019)，提示 CD3 + 比例越高，CD8/CD4 比值越低，可能与 CD4+ T 细胞增殖能力更强相关。

图.3 TIL 亚群比例与细胞因子分泌的相关性

该图明确 TIL 亚群功能差异。(A)CD4+ T 细胞比例与细胞毒性分子(sFasL、颗粒酶 A/B、穿孔素、颗粒溶素)呈显著负相关(p 值 0.0006-<0.0001)，与 CD3+ T 细胞的相关性趋势相反;(B)CD8+ T 细胞比例与颗粒溶素(p=0.025)、颗粒酶 A(p=0.029)呈正相关;CD3 + 和 CD8+ T 细胞比例均与 IL-17A 呈负相关(p=0.017、p=0.018)。

图.4 TIL 亚群比例与 TCR 特征的相关性

该图显示 CD4+ TILs 的独特 TCR 特征。(A)CD4+ T 细胞比例与 TRA CDR3 核苷酸长度呈显著正相关(p=0.03);(B)CD4+ T 细胞比例与 TRB N (D) N 核苷酸长度呈显著负相关(p=0.03);CD3+、CD8+ T 细胞比例与所有 TCR 特征(长度、电荷、疏水性等)均无显著相关性。

图.5 TIL 亚群比例与 TCR 库多样性的相关性

该图揭示 CD4+ TILs 的 TCR 库特性。CD4+ T 细胞比例与 TRA(p=0.035)、TRB(p=0.004)的 nS-W 多样性指数均呈显著负相关;CD3+ T 细胞比例的多样性趋势与 CD4 + 一致;CD8+ T 细胞比例与多样性无显著相关性，但呈微弱正向趋势;高浸润区 CD4+ T 细胞即使比例低仍保持较高多样性，低浸润区 CD4 + 多样性持续降低。

全文总结

本研究通过最小扩增培养方法(低 IL-2 补充)保留了乳腺癌 TILs 在肿瘤微环境中的原始生物学特性，系统阐明 CD4 + 和 CD8+ TIL 亚群的表型、功能及 TCR 库差异。核心发现包括：高 TIL 浸润区 CD3 + 比例高，CD4 + 与 CD8+ T 细胞共存;低浸润区 CD4 + 占优且与细胞毒性分子呈负相关，TCR 库多样性更低;CD4+ TILs 具有独特 TCR 特征(TRA CDR3 长、TRB N (D) N 短)，CD8+ TILs 无显著 TCR 特征关联。该研究证实最小扩增 TILs 可反映肿瘤原始免疫状态，其亚群组成、功能及 TCR 库特性可指导免疫治疗中高治疗潜力 TILs 的筛选(优先选择高浸润、CD4 + 与 CD8 + 平衡、细胞毒性分子高表达、TCR 多样性高的区域)，为乳腺癌 TILs 过继细胞治疗的优化提供重要实验依据。