ciRS-187 通过靶向 miR-187 调控 BMP15 和 GDF9 处理的牛卵丘细胞中 BMPR2 表达

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：CiRS-187 regulates BMPR2 expression by targeting miR-187 in bovine cumulus cells treated with BMP15 and GDF9

中文标题：CiRS-187 通过靶向 miR-187 调控 BMP15 和 GDF9 处理的牛卵丘细胞中 BMPR2 表达

发表期刊：《Theriogenology》

影响因子：2.5

作者单位：

1.Department of Laboratory Animal Science, College of Animal Sciences, Jilin University, Changchun, 130062, China

2.National Engineering Laboratory for Animal Breeding, Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of the Ministry of Agricultural, Beijing Key Laboratory for Animal Genetic Improvement, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing, 100190, China

作者信息：

第一作者：Yao Fu、Jia-Bao Zhang(并列一作)

通讯作者：Bao Yuan

研究背景

哺乳动物卵泡发育过程中，卵丘细胞对卵母细胞起保护与营养供给作用，卵母细胞可旁分泌因子调控颗粒细胞生理状态，二者双向信号交换是卵泡正常发育的核心;骨形态发生蛋白 15(BMP15)和生长分化因子 9(GDF9)是卵母细胞分泌的 TGFβ 超家族关键因子，通过结合卵丘细胞上的 Ⅱ 型骨形态发生蛋白受体(BMPR2)激活下游信号，调控卵丘细胞增殖、凋亡，进而影响卵泡发育与卵母细胞成熟;已有研究证实 miRNA 可直接靶向调控 BMPR2 表达，但 circRNA 作为内源竞争性 RNA(ceRNA)海绵 miRNA 调控 BMPR2 的机制，在 BMP15/GDF9 介导的卵泡发育调控中尚未被阐明;本研究首先明确 BMP15 和 GDF9 处理牛卵丘细胞的最优条件，筛选靶向 BMPR2 的 miR-187，鉴定海绵 miR-187 的 circRNA ciRS-187，探究 ciRS-187/miR-187/BMPR2 调控轴对 BMPR2 表达及卵丘细胞凋亡的影响，揭示 circRNA 参与卵泡发育的 ceRNA 调控新机制。

研究方法

本研究无菌分离牛卵巢卵丘细胞进行体外培养，设置 BMP15 单独处理、GDF9 单独处理、BMP15+GDF9 联合处理组，通过 CCK-8 法检测细胞增殖活性、流式细胞术检测细胞凋亡水平，确定最优处理浓度与时间;采用 TargetScan 软件预测靶向 BMPR2 3'UTR 的候选 miRNA，在 293T 细胞中进行双荧光素酶报告基因实验验证结合关系，RT-qPCR 筛选显著抑制 BMPR2 表达的 miR-187;通过 circBase 数据库、miRanda 与 RNAhybrid 软件预测靶向 miR-187 的 circRNA，结合高通量测序结果筛选与 BMPR2 表达趋势一致的 ciRS-187;设计并合成 3 条 ciRS-187 的 siRNA，转染牛卵丘细胞构建敲低模型，采用 RT-qPCR 检测 ciRS-187、miR-187、BMPR2 的 mRNA 表达水平，Western blot 检测 BMPR2 蛋白表达水平，流式细胞术检测卵丘细胞凋亡水平;所有实验均独立重复至少 3 次，数据以均值 ± 标准误表示，采用单因素方差分析与 Student's t 检验进行统计学分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图 1 BMP15 和 GDF9 处理对牛卵丘细胞及 BMPR2 表达的影响

本图确定 BMP15 和 GDF9 处理牛卵丘细胞的最优条件与调控效应。A 图 CCK-8 增殖检测显示，BMP15、GDF9 单独及联合处理均显著促进卵丘细胞增殖，其中 50 ng/ml BMP15+100 ng/ml GDF9 联合处理组增殖效果最显著;B 图流式凋亡检测显示，三种处理方式均显著抑制卵丘细胞凋亡，联合处理组凋亡率最低;C 图时间梯度检测显示，处理 48 h 时细胞增殖促进效果最明显，确定 48 h 为最优处理时间;D 图 RT-qPCR 结果显示，BMP15 和 GDF9 处理均显著上调 BMPR2 的 mRNA 表达，联合处理组上调幅度最大，证实 BMP15/GDF9 可正向调控 BMPR2 表达。

图 2 靶向 BMPR2 3'UTR 候选 miRNA 的筛选

本图完成靶向 BMPR2 的 miRNA 筛选与验证。A 图双荧光素酶报告实验显示，将 29 个候选 miRNA 分别与 BMPR2 3'UTR 荧光报告质粒共转染，9 个 miRNA 可显著降低荧光素酶活性，初步确定为候选 miRNA;B 图 RT-qPCR 检测显示，转染这 9 个 miRNA 模拟物后，牛卵丘细胞中 BMPR2 的 mRNA 表达均显著下调，与荧光素酶实验结果一致，研究随机选取 miR-187 开展后续机制研究。

图 3 miR-187 靶向结合 BMPR2 3'UTR 的验证

本图证实 miR-187 直接靶向抑制 BMPR2 表达。A 图展示 miR-187 与 BMPR2 3'UTR 的种子区结合位点;B 图 RT-qPCR 显示，转染 miR-187 mimic 后 miR-187 表达显著升高，转染 inhibitor 后显著降低，证明转染有效;C 图 RT-qPCR 显示，miR-187 mimic 显著下调 BMPR2 mRNA 表达，inhibitor 显著上调其表达;D-E 图 Western blot 结果与 mRNA 水平一致，miR-187 mimic 抑制 BMPR2 蛋白表达，inhibitor 促进其表达，明确 miR-187 可直接靶向负调控 BMPR2。

图 4 靶向 miR-187 的 circRNA ciRS-187 的鉴定

本图筛选并验证 ciRS-187 为 miR-187 的海绵 circRNA。A 图展示 ciRS-187(bta_circRNA_11396)与 miR-187 的种子区互补结合序列;B 图 RT-qPCR 显示，BMP15 单独、GDF9 单独、二者联合处理均显著上调 ciRS-187 的表达，其表达趋势与 BMPR2 完全一致，符合 ceRNA 调控特征，结合结合能力与序列长度，最终确定 ciRS-187 为靶标 circRNA。

图 5 敲低 ciRS-187 下调 BMPR2 表达的验证

本图证实 ciRS-187 通过海绵 miR-187 正向调控 BMPR2。A 图 RT-qPCR 显示，3 条 siRNA 中 siR-circ10_001 对 ciRS-187 的敲低效率最高(68%)，选用该序列开展后续实验;B-C 图 RT-qPCR 显示，敲低 ciRS-187 后，miR-187 表达显著上调，BMPR2 mRNA 表达显著下调;D-E 图 Western blot 显示，BMPR2 蛋白表达同步显著降低，证明 ciRS-187 可抑制 miR-187 表达，进而解除其对 BMPR2 的抑制作用。

图 6 敲低 ciRS-187 促进牛卵丘细胞凋亡

本图揭示 ciRS-187 对卵丘细胞凋亡的调控作用。A-C 图流式细胞术检测显示，敲低 ciRS-187 后，牛卵丘细胞的凋亡率显著高于对照组，结合 BMPR2 可抑制卵丘细胞凋亡的已知功能，证实 ciRS-187 通过上调 BMPR2 发挥抗凋亡作用，敲低 ciRS-187 则通过降低 BMPR2 表达促进细胞凋亡。

图 7 ciRS-187 在牛卵丘细胞中的调控机制模式图

本图总结全文调控机制：BMP15 和 GDF9 处理上调 ciRS-187 表达，ciRS-187 作为 ceRNA 海绵吸附 miR-187，抑制 miR-187 的表达与功能，解除 miR-187 对 BMPR2 的靶向抑制，最终上调 BMPR2 表达，抑制牛卵丘细胞凋亡，参与卵泡发育调控。

研究结论

本研究成功确定 50 ng/ml BMP15+100 ng/ml GDF9 处理 48 h 为调控牛卵丘细胞的最优条件，证实该处理可显著促进细胞增殖、抑制凋亡并上调 BMPR2 表达;筛选并验证 miR-187 可直接靶向结合 BMPR2 3'UTR 并负向调控其表达;鉴定 ciRS-187 为靶向 miR-187 的内源竞争性 circRNA，敲低 ciRS-187 可上调 miR-187、下调 BMPR2 并促进卵丘细胞凋亡;首次阐明 ciRS-187/miR-187/BMPR2 ceRNA 调控轴在 BMP15/GDF9 介导的牛卵丘细胞功能调控中的分子机制，为理解非编码 RNA 参与哺乳动物卵泡发育的调控网络提供了全新理论依据。