胎儿结肠细胞来源的人肠道类器官：肠道病毒致病研究的新模型

肠道病毒(如 EV71、柯萨奇病毒 B3、埃可病毒 6)是引起手足口病、病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎等疾病的重要病原体，尤其对婴幼儿危害显著。传统研究依赖 2D 单层细胞模型(如 RD、FHC 细胞)，但这类模型缺乏肠道上皮的细胞多样性(如杯状细胞、潘氏细胞)和 3D 结构，无法模拟体内病毒 - 宿主交互;动物模型则因宿主物种差异，难以准确反映人类肠道病毒感染特征。

暨南大学团队在《Virulence》上发表题为A human intestinal organoid derived from fetal human colon cells model for studying enteroviral pathogenesis的研究，首次构建胎儿结肠细胞(FHC)来源的 3D 人肠道类器官(HIOs)模型：该模型包含肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等关键细胞类型，支持 EV71、CVB3、ECHO6 等多种肠道病毒高效复制(病毒滴度是 2D 模型的 5-10 倍)，且明确杯状细胞是病毒主要复制位点。该模型为肠道病毒致病机制研究、抗病毒药物筛选提供了生理相关性更强的体外工具。

实验方法

1. 人肠道类器官(HIOs)的构建与培养

细胞准备：胎儿结肠细胞(FHC，ATCC CRL-1831)在含 10% FBS 的 DMEM 中 2D 贴壁培养，胰酶消化为单细胞悬液(5×10⁶细胞 /mL)。

3D 培养：30μL 单细胞悬液与 270μL 稀释 Matrigel(含 10% FBS、青霉素 / 链霉素)混合，接种于低吸附 24 孔板，添加 10μM Y27632(ROCK 抑制剂);37℃、5% CO₂培养 7-10 天，待形成球形类器官后换分化培养基，每 3-4 天换液，传代比例 1:3。

2. HIOs 的鉴定

形态与组织学：HE 染色观察 HIOs 结构，测量直径(3-30 天);qPCR 检测肠道细胞标志物(肠上皮 CDX1/VILLIN、杯状细胞 MUC2、肠内分泌细胞 Neurog3)、分化基因(KRT20)及干细胞基因(KLF4/OLFM4)的 RNA 表达。

免疫荧光验证：HIOs 经 4% 多聚甲醛固定、0.4% Triton X-100 透化后，用 ALPL(肠上皮标志物)、MUC2(杯状细胞)、β- 连环蛋白(细胞连接)一抗孵育，荧光二抗标记，DAPI 染核，共聚焦显微镜成像。

3. 肠道病毒感染实验

病毒准备：EV71(襄阳株，JN230523.1)、CVB3(Nancy 株)、ECHO6(D-1 株)在 RD 细胞中扩增，滴度分别为 2.21×10⁷、3.62×10⁸、1.5×10⁷ PFU/mL。

感染操作：HIOs(7/14/21 天龄)与病毒以 MOI=0.5 共孵育，2 小时后弃游离病毒，换含 2% FBS 的培养基;分别在 8、12、24、48hpi 取样，2D FHC 细胞作为对照。

4. 病毒复制检测

RNA 定量：Trizol 提取样本 RNA，反转录为 cDNA，qPCR 检测病毒 VP1 基因(EV71/CVB3/ECHO6)，以 GAPDH 为内参，计算相对表达量。

病毒滴度测定：收集感染上清，10 倍梯度稀释后接种 RD 细胞，观察细胞病变(CPE)，Reed-Muench 法计算 TCID₅₀。

5. 病毒复制的细胞定位

免疫荧光共定位：感染后 HIOs 用抗 dsRNA 抗体(病毒复制标志物)、细胞类型特异性抗体(MUC2 - 杯状细胞、ChrA - 肠内分泌细胞、LysoC - 潘氏细胞)孵育，荧光二抗标记，DiI 染细胞膜，DAPI 染核，共聚焦成像并定量 dsRNA 平均荧光强度(MFI)。

关键结果

图1：人肠道类器官(HIOs)的构建与鉴定

该图证实 FHC 细胞可成功分化为 HIOs：A 显示 FHC 细胞 2D 贴壁生长，3D 培养 3-30 天形成球形结构，直径随培养时间增至 100μm 以上;B 为 HE 染色，HIOs 结构紧密，无明显坏死核心;C 为 qPCR 结果，3D 培养后肠上皮标志物(CDX1、VILLIN)、杯状细胞标志物(MUC2)、分化基因(KRT20)显著上调(p<0.05)，干细胞基因(KLF4、OLFM4)下调;D-E 为免疫荧光，7/14 天龄 HIOs 中 ALPL(肠上皮，红色)、MUC2(杯状细胞，红色)与 β- 连环蛋白(绿色)共定位，证实 HIOs 包含多种肠道上皮细胞类型，构建成功。

图2-4：EV71 在不同培养时间 HIOs 中的感染与定位

这三组图分别展示 7 天(图 2)、14 天(图 3)、21 天(图 4)龄 HIOs 感染 EV71 的结果：A 为 dsRNA(病毒复制，绿色)与 ChrA(肠内分泌细胞，黄色)共定位，MFI 随感染时间增加但共定位较弱;B 为 dsRNA 与 MUC2(杯状细胞，黄色)共定位，MFI 在 48hpi 达峰值(7 天龄约 3.5、21 天龄约 5)，共定位信号最强;C 为 dsRNA 与 LysoC(潘氏细胞，黄色)共定位，信号最弱。结果表明，EV71 在 HIOs 中主要在杯状细胞复制，且 21 天龄 HIOs 的病毒复制水平最高，与肠道分化成熟度正相关。

从左到右，依次为图2、3、4

图5：EV71 在 2D 与 3D HIOs 中的复制差异及药物筛选

该图对比病毒复制效率与模型药物适用性：A-B 为 qPCR 与 TCID₅₀结果，3D HIOs(7/14/21 天龄)的 EV71 VP1 RNA 水平和病毒滴度均显著高于 2D 细胞，21 天龄 HIOs 最高(RNA 水平是 2D 的 10 倍，滴度达 8×10⁶ TCID₅₀/mL);C 为药物筛选，用氯喹(CQ，自噬抑制剂)和毒胡萝卜素(TG，ER 应激激活剂)处理 14 天龄 HIOs，计算 IC₅₀分别为 11.64μM 和 2.886μM，证实模型可用于抗病毒药物活性评估。

图6：CVB3 在 HIOs 中的复制

该图验证 HIOs 对 CVB3 的支持能力：A 为形态观察，2D FHC 细胞感染后出现明显 CPE(细胞脱落)，3D HIOs 结构分散;B-C 为 qPCR 与 TCID₅₀结果，21 天龄 HIOs 的 CVB3 VP1 RNA 水平(48hpi 约 4×10⁻¹)和病毒滴度(48hpi 达 2×10⁷ TCID₅₀/mL)均显著高于 2D 细胞(p<0.05)，表明 HIOs 同样支持 CVB3 高效复制。

图7：ECHO6 在 HIOs 中的复制

该图验证模型对 ECHO6 的适用性：A 为形态，2D 细胞感染后 CPE 明显，3D HIOs 解体;B-C 为 qPCR 与 TCID₅₀结果，21 天龄 HIOs 的 ECHO6 VP1 RNA 水平(48hpi 约 3×10⁻¹)和病毒滴度(48hpi 达 8×10⁶ TCID₅₀/mL)显著高于 2D 细胞(p<0.05)，证明 HIOs 对多种肠道病毒具有普适性。

全文总结

本研究成功构建胎儿结肠细胞(FHC)来源的 3D 人肠道类器官(HIOs)，解决了传统 2D 模型生理相关性不足的问题：1)HIOs 包含肠上皮、杯状、肠内分泌等关键细胞类型，培养 21 天分化最成熟，可稳定传代;2)支持 EV71、CVB3、ECHO6 等多种肠道病毒高效复制，病毒滴度是 2D 模型的 5-10 倍，且明确杯状细胞是病毒主要复制位点(可能与杯状细胞干扰素应答较弱相关);3)可用于抗病毒药物筛选，成功测定氯喹、毒胡萝卜素的抗 EV71 活性(IC₅₀分别为 11.64μM、2.886μM)。

该模型的优势在于：来源简单(FHC 细胞无需复杂分化)、成本低、生理相关性强;局限性包括缺乏免疫细胞和肠道菌群，无法模拟体内免疫清除过程，且 HIOs 存活期约 30 天。未来可通过引入免疫细胞共培养、优化培养基延长存活期，进一步提升模型价值。总体而言，该 HIOs 模型为肠道病毒致病机制研究和抗病毒研发提供了可靠工具，有望减少动物模型的使用。