塞内卡病毒 A（SVA）在顶向外猪肠道类器官中的复制与宿主反应

塞内卡病毒 A(SVA)可致猪水疱病，临床症状类似口蹄疫，且常引发仔猪腹泻、肠道绒毛萎缩等肠道问题，但 SVA 对肠道上皮的感染机制尚未明确。传统体外模型(如猪睾丸细胞 ST、肾细胞 PK-15)无法模拟肠道上皮的细胞组成与极性，难以还原 SVA 在肠道中的真实感染过程。

东北农业大学团队在《Virulence》上发表题为Senecavirus a can replicate in apical-out porcine intestinal organoids and induce stress granules and innate immune response的研究，首次构建顶向外(apical-out)猪肠道类器官模型—— 该模型含肠道干细胞、肠上皮细胞等关键细胞类型，极性反转后肠上皮顶端暴露，可直接与 SVA 接触。研究证实 SVA 能在该模型中高效复制，明确其感染顺序，并发现 SVA 诱导短暂应激颗粒(SGs)形成且激活先天免疫反应，为解析 SVA 肠道感染机制提供关键工具。

实验方法

1. 顶向外猪肠道类器官构建

取 7 日龄仔猪空肠段，剪为 2mm 片段，PBS 冲洗后用细胞解离试剂处理，过滤离心获取隐窝;50 个隐窝 / 孔，用 Matrigel 与类器官培养基混合接种，37℃孵育后培养 8 天形成 3D 类器官;再用 5mM 冷 EDTA 处理类器官 1 小时(4℃)，在含 10μM Y-27632 的培养基中悬浮培养 3 天，实现极性反转(顶端向外)。

2. 类器官细胞类型鉴定

类器官经固定、透化、封闭后，用肠道干细胞(Lgr5)、肠上皮细胞(Villin)、杯状细胞(Muc2)等标志物一抗孵育，荧光二抗标记，DAPI 染核，共聚焦显微镜成像验证细胞组成。

3. SVA 感染实验

顶向外类器官用 SVA LJ-2021 株(MOI=6)孵育 2 小时，洗涤后继续培养，在 0-24hpi 取样;明场显微镜观察细胞病变，免疫荧光检测 SVA-N 蛋白与顶膜标志物 ZO-1 共定位，验证感染有效性。

4. 病毒载量与应激颗粒检测

收集感染后类器官和上清，提取 RNA 并反转录为 cDNA，RT-qPCR 检测 SVA-N 基因，根据标准曲线计算病毒拷贝数;免疫荧光染色 SGs 核心成分 GAPDH，ImageJ 定量 SGs 阳性细胞比例。

5. 先天免疫基因表达分析

提取感染 12hpi 和 24hpi 类器官的 RNA，RT-qPCR 检测 IFN-α、ISG-15、OAS1 等先天免疫基因相对表达量，用 2^(-ΔΔCt) 法计算。

关键结果

图1：顶向外猪肠道类器官的建立与验证

该图证实模型构建成功：A 显示隐窝培养 8 天形成含隐窝样突起的成熟类器官;B 表明类器官冻存复苏后可传代 20 代;C 显示极性反转后类器官结构紧凑、无明显腔隙;D 通过免疫荧光证实，顶向外类器官中顶膜标志物 ZO-1 转移至外层，基底膜标志物 β-catenin 在内层，极性反转成功;E 验证顶向外类器官含肠道所有关键细胞类型，与基底向外类器官组成一致。

图2：SVA 在顶向外类器官中的复制

该图验证 SVA 感染能力：A 显示感染 24hpi 后类器官解体，mock 组结构完整;B 免疫荧光证实 12hpi 时顶向外类器官外层(ZO-1 阳性区)有 SVA-N 蛋白表达，基底向外类器官信号微弱;C 显示类器官内病毒拷贝数 12hpi 达峰值(2.9×10⁷ copies/μL)，是 1hpi 的 60 倍，上清中病毒载量 48hpi 达最高，证实 SVA 高效复制并释放。

图3：SVA 感染的细胞类型顺序

该图明确感染顺序：4hpi 时 SVA-N 与肠上皮细胞标志物 Villin 共定位;8hpi 与肠内分泌细胞 ChgA 共定位;12hpi 与潘氏细胞 Lyz、肠道干细胞 Lgr5 共定位;20hpi 与增殖细胞 Ki67 共定位;所有时间点均未与杯状细胞 Muc2 共定位。表明 SVA 感染顺序为肠上皮细胞→肠内分泌细胞→潘氏细胞→肠道干细胞→增殖细胞，肠上皮细胞是主要初始靶细胞。

图4：SVA 诱导的应激颗粒(SGs)动态变化

该图揭示 SGs 变化：A 显示 0hpi 时 G3BP1 弥散，4hpi 出现大量点状 SGs，8-16hpi 减少，20hpi 几乎消失;B 定量显示 4hpi 时 SGs 阳性细胞比例达 8.2%(p<0.05)，20hpi 降至 1% 以下。证实 SVA 诱导短暂 SGs 形成，早期为宿主防御，后期可能被病毒破坏。

图5：SVA 感染诱导的先天免疫基因表达

该图分析免疫基因变化：24hpi 时先天免疫基因上调幅度显著高于 12hpi，IFN-α 上调 9 倍，ISG-15 上调 11 倍，OAS1 上调 8.4 倍，STAT1、IL-6、Muc2 也显著上调(p<0.05)。表明 SVA 感染后期激活先天免疫，通过 IFN-α-ISG 轴和黏膜屏障基因限制病毒复制。

全文总结

本研究构建顶向外猪肠道类器官模型，该模型含肠道关键细胞类型，极性反转后可模拟体内肠道上皮与病原体的接触，为 SVA 肠道感染研究提供可靠平台。核心发现：1)SVA 在顶向外类器官中高效复制，12hpi 达病毒峰值，24hpi 后因先天免疫激活下降;2)SVA 优先感染肠上皮细胞，再扩散至肠内分泌细胞、潘氏细胞等，杯状细胞不敏感;3)SVA 感染早期诱导 SGs，后期 SGs 消散;4)感染 24hpi 时 IFN-α、ISG-15 等先天免疫基因及 Muc2 显著上调，限制病毒复制。研究首次揭示 SVA 在猪肠道上皮的感染规律，为后续机制研究和药物筛选提供工具，也为理解 SVA 致肠道损伤提供新视角。