DMSO 促进人诱导多能干细胞向肾祖细胞与肾脏类器官高效分化：机制与应用价值

肾脏类器官作为模拟胎儿肾脏发育的体外模型，在肾病研究、药物毒性筛选中具有重要价值，但现有分化方案(如 Morizane 等 2017 年建立的 2D 分步 protocol)存在效率低、肾祖细胞比例不足、类器官成熟度不均等问题。人诱导多能干细胞(hiPSCs)处于 “始发态(primed)” 多能性，其分化潜能受细胞周期、表观遗传状态调控。此前研究发现低剂量二甲基亚砜(DMSO)可通过调控细胞周期(G1 期停滞)增强 hiPSCs 向三胚层分化，但 DMSO 对肾脏类器官分化的影响及机制尚未明确。

来自荷兰马斯特里赫特大学等机构的团队在《Stem Cell Reviews and Reports》上发表题为Dimethyl Sulfoxide Conditions Induced Pluripotent Stem Cells for more Efficient Nephron Progenitor and Kidney Organoid Differentiation的研究，证实1-2% DMSO 短期(24 小时)处理 hiPSCs可通过调节细胞周期、重塑表观遗传景观、优化集落形态，显著提高后肾间充质肾祖细胞(SIX2+)比例(最高达 92%)及肾脏类器官分化效率(1% DMSO 组类器官形成率 78%，对照 38%)，为肾脏类器官的高效构建提供简单可行的优化策略。

实验方法

1. hiPSC 培养与 DMSO 处理

细胞系与培养：使用 3 株 hiPSCs(LUMC：尿液来源;H101、H107：外周血单核细胞来源)，在 1% Geltrex 包被板上用 mTeSRplus 培养基培养，传代时用温和解离试剂处理。

DMSO 处理：hiPSCs 按不同密度接种(LUMC 1×10⁴细胞 /cm²，H101 9×10³，H107 7×10³)，培养 3 天后，用含 0%(对照)、1%、2% DMSO 的 mTeSRplus 处理 24 小时，随后启动肾脏类器官分化。

2. 肾脏类器官分化(基于 Morizane 等 2017 protocol 优化)

中胚层诱导(Day 0-4)：DMSO 处理后，换用含 CHIR99021(Wnt 激动剂，LUMC 8μM、H101 10μM、H107 12μM)和 5ng/mL Noggin(BMP 抑制剂)的 Advanced RPMI 培养基，2 天换液 1 次;Day 4 换用含 10ng/mL Activin A 的培养基，持续 3 天。

肾祖细胞诱导(Day 7-9)：Day 7 换用含 10ng/mL FGF9 的培养基，Day 9 观察到囊泡结构，提示后肾间充质(MM)肾祖细胞形成。

类器官成熟(Day 14-21)：Day 14 换用基础 Advanced RPMI 培养基，每 2-3 天换液，Day 21 获得含肾小管结构的肾脏类器官。

3. 细胞特性检测

多能性评估：流式细胞术检测表面标志物(TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA3/4)和 intracellular 标志物(SOX2、OCT4);qPCR 检测多能性基因(SOX2、OCT4、NANOG、c-Myc)。

细胞周期分析：PI 染色结合流式，检测 G0/G1、S、G2/M 期细胞比例;scRNA-seq 分析细胞周期相关基因(如 CCND1/2/3、CDKN1B)。

毒性与应激检测：LDH 释放实验评估细胞毒性;CellROX Green 检测活性氧(ROS);qPCR 检测热休克蛋白(HSPA5、HSP90B1)。

4. 肾祖细胞与类器官鉴定

肾祖细胞定量：Day 9 用流式细胞术检测 SIX2 + 细胞比例(肾祖细胞标志物);免疫荧光染色验证 SIX2 与 PAX2(后肾间充质标志物)共表达。

类器官成熟度评估：Day 21 手动计数类器官数量;免疫荧光检测肾小球标志物(Podocalyxin、Nephrin)、近端小管标志物(Megalin、LTL)、远端小管 / 集合管标志物(GATA3、E-cadherin);In-cell Western 定量关键蛋白表达。

5. 转录组与表观遗传分析

单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)：处理后 hiPSCs 经固定、分选后，用 10x Genomics 平台测序，分析多能性状态(naive/formative/primed)、表观调控基因(DNMT3A/B、TET 家族)及凋亡相关基因。

qPCR 验证：检测中胚层(TBXT、MIXL1)、中间中胚层(OSR1、LHX1、PAX2)标志物表达，验证分化定向性。

关键结果

图1：DMSO 对 hiPSCs 多能性与细胞周期的影响

该图解析 DMSO 处理对 hiPSCs 基础特性的调控：A 为处理流程示意图，hiPSCs 接种 3 天后用 DMSO 处理 24 小时，Day 0 启动分化;B-C 显示，1-2% DMSO 处理使 G0/G1 期细胞比例显著增加(剂量依赖性)，总细胞数减少，但 Ki67 + 增殖细胞比例无显著下降，提示 DMSO 诱导细胞周期停滞而非抑制增殖;D-E 显示，DMSO 处理后 LDH 释放增加(提示轻度细胞毒性)，但 ROS 水平无变化，HSPA5(热休克蛋白)上调，证实存在轻度应激但无氧化损伤;F-I 为 qPCR 结果，SOX2、c-Myc 表达稳定，OCT4 轻度下降，NANOG 显著下调(2% DMSO 组最明显)，说明多能性核心状态保留但 “过度增殖相关” 的 NANOG 表达降低;J-K 为 scRNA-seq 结果，DMSO 处理下调细胞周期基因(CCND1/2/3)、上调周期抑制剂 CDKN1B，同时下调表观调控基因(DNMT3A/B、TET 家族)，证实 DMSO 通过 “G1 期停滞 + 表观重塑” 为分化做准备，且未诱导提前向三胚层分化(图S3f)。

图2：DMSO 对 hiPSC 集落形态的动态影响

该图通过实时成像量化集落形态变化：A 为 LUMC-GFP+ hiPSCs 的荧光图像，0 小时各组集落形态相似，24 小时后 DMSO 组集落更紧凑、圆形度更高;B-E 为定量分析，1-2% DMSO 组集落数量增加( fewer 融合)、周长减少、凸度和圆形度显著升高(p<0.05)。集落的 “小而圆” 形态是 hiPSCs 分化潜能提升的典型特征 —— 边缘细胞比例增加，更易响应分化信号，为后续肾祖细胞分化奠定形态基础。

图3：DMSO 对 hiPSC 细胞结构与整合素表达的影响

该图揭示 DMSO 对细胞骨架与基质交互的调控：A 为 Phalloidin 染色(F-actin)，DMSO 组集落边缘细胞突起减少( focal adhesion 减少)， cytoskeleton 更紧凑;B-J 为 qPCR 结果，E-cadherin(细胞间黏附)稳定，N-cadherin 上调，PTK2( focal adhesion kinase)、Vimentin(间质标志物)及整合素 β1/β5 下调，证实 DMSO 通过调节细胞 - 基质黏附(如整合素下调)和细胞骨架重组，减少不必要的 focal adhesion，使细胞更易接受分化信号，而非维持自我更新所需的基质锚定状态。

图4：DMSO 对 hiPSCs 向中胚层分化的定向调控

该图验证 DMSO 对分化早期阶段的影响：A 为中胚层诱导流程，DMSO 处理后用 CHIR+Noggin 诱导;B 显示，DMSO 组在分化 Day 2-4 的 LDH 释放减少，提示 DMSO 预处理增强细胞对分化压力的耐受性;C-I 为 qPCR 结果，NANOG 在各组均下调(证实退出多能性)，SOX17(内胚层)仅在对照上调(DMSO 抑制内胚层偏移)，TBXT/MIXL1(原条标志物)在各组均上调(成功诱导中胚层);J-O 显示，PAX2(中间中胚层)在 1% DMSO 组 Day 4 显著上调，OSR1/LHX1(中间中胚层)表达稳定，证实 DMSO 可定向促进中间中胚层分化(肾脏发育的关键前体)，同时抑制内胚层等 off-target lineage。

图5：DMSO 促进 hiPSCs 向 SIX2 + 肾祖细胞分化

该图是核心结果，证实 DMSO 对肾祖细胞生成的促进作用：A 为肾祖细胞诱导流程，Day 9 为肾祖细胞成熟时间点;B-C 为免疫荧光，1% DMSO 组 SIX2+(绿色)与 PAX2+(红色)细胞广泛共表达，对照组成熟度低;D-E 为定量，流式检测显示 1% DMSO 组 SIX2 + 细胞比例达 92%，显著高于对照的 69% 和 2% DMSO 的 83%，且细胞密度最高(12×10⁵细胞 /cm²)。SIX2 是后肾间充质肾祖细胞的关键标志物，其比例需达 80-90% 才能高效形成肾脏类器官，该结果直接证实 1% DMSO 是最优浓度，可最大化肾祖细胞产量。

图6：DMSO 提升肾脏类器官分化效率与成熟度

该图评估 DMSO 对类器官终末成熟的影响：A 为类器官成熟流程，Day 9 至 Day 21 为肾单位形成阶段;B-D 为类器官形成率，1% DMSO 组 78% 的孔出现管状结构，显著高于对照的 38% 和 2% DMSO 的 50%;E-H 为 In-cell Western 定量，总蛋白信号与类器官数量正相关，Podocalyxin(肾小球)表达无差异，Megalin(近端小管)轻度上调，GATA3(远端小管 / 集合管)在 2% DMSO 组显著上调;I-J 为免疫荧光，各组类器官均表达肾小球(Podocalyxin/Nephrin)、近端小管(LTL/Megalin)、远端小管(E-cadherin/GATA3)标志物，DMSO 组管状结构更密集。结果证实，DMSO 不仅提高类器官形成率，还促进远端小管 / 集合管成熟，且效果在 1% DMSO 时最优。

全文总结

本研究证实低剂量 DMSO(1%)短期(24 小时)处理是提升 hiPSCs 向肾脏类器官分化效率的简单策略，核心机制与应用价值体现在三方面：1)细胞周期与表观调控：DMSO 通过上调 CDKN1B 诱导 G1 期停滞，下调 DNMT3A/B 重塑表观景观，使 hiPSCs 从 “自我更新态” 转向 “分化准备态”，且保留多能性核心(SOX2/OCT4 稳定);2)分化定向性优化：抑制内胚层偏移(SOX17 下调)、促进中间中胚层(PAX2 上调)，最终使 SIX2 + 肾祖细胞比例达 92%(对照 69%)，解决肾祖细胞不足的关键瓶颈;3)类器官效率与成熟度提升：1% DMSO 组类器官形成率达 78%(对照 38%)，且远端小管 / 集合管标志物 GATA3 表达增加，类器官功能分区更完整。研究局限性包括：DMSO 的长期表观遗传影响需进一步验证，类器官缺乏血管结构(需后续共培养优化)。总体而言，DMSO 处理作为低成本、易操作的优化步骤，可广泛应用于肾脏类器官构建，为肾病模型、药物筛选提供高效工具。