成纤维细胞促进成体猫小肠类器官生长：弓形虫研究新工具

猫小肠类器官是研究肠道病原体(如弓形虫)的关键模型，但传统培养存在生长慢、早衰老问题，尤其弓形虫性发育仅能在猫肠道完成，现有模型无法长期支持。

美国威斯康星大学麦迪逊分校团队在《mSphere》上发表题为Fibroblasts enhance the growth and survival of adult feline small intestinal organoids的研究，建立成体猫小肠类器官与 MMC 灭活人类包皮成纤维细胞(HFF)共培养体系：使猫空肠类器官存活至少 9 个月(传代 45 次)，增大体积，并支持弓形虫前性发育(GRA11b 阳性)，且培养 21 天的类器官 GRA11b 阳性率高于 10 天的，既减少实验猫使用，也为难培养物种类器官研究提供参考。

实验方法

1. 猫小肠类器官分离与初始培养

取成体猫空肠 / 回肠段，3mM EDTA 冰浴处理 60 分钟，摇晃释放隐窝，过滤离心获取;50 个隐窝 / 孔，用 Matrigel 与含 L-WRN 条件培养基的类器官培养基混合接种，37℃孵育凝固后加培养基，每 2-3 天换液。

2. HFF 共培养体系构建

HFF 用 10μg/mL MMC 处理 2-3 小时，消化后以 2×10⁵细胞 /cm² 接种 24 孔板;在 HFF 单层放盖玻片(避免直接接触)，滴加 Matrigel 包埋的类器官，孵育凝固后加培养基，每 3-7 天传代。

3. 类器官鉴定与生长监测

明场显微镜观察形态，ImageJ 定量类器官数量和直径;免疫荧光染色肠道干细胞(Lgr5)、肠上皮细胞(Villin)等标志物，共聚焦成像验证细胞组成。

4. 弓形虫感染实验

类器官消化为单细胞，接种于 ECL 包被盖玻片，培养 10-21 天形成单层;感染前 24 天换 “感染培养基”，用弓形虫脑源缓殖子(2×10⁴个 / 孔)感染，37℃培养 5 天。

5. 弓形虫前性发育检测

感染单层固定透化后，用抗弓形虫抗体、抗 GRA11b 抗体孵育，荧光二抗标记，DAPI 染核，共聚焦成像并计数 GRA11b 阳性空泡比例。

关键结果

图1：小肠结构与类器官 - HFF 共培养示意图

左侧展示小肠上皮细胞类型及分区，右侧明确 “隐窝分离→类器官生长→HFF 共培养” 流程：HFF 需 MMC 灭活，类器官接种于盖玻片避免直接接触 HFF，每传代需重新制备 HFF 饲养层，为实验提供清晰操作框架。

图2：HFF 促进猫类器官早期生长与存活

以猫 0 类器官为例，HFF + 组传代 4 时每孔类器官达 40-250 个，HFF - 组仅 10-40 个且传代 5 全死亡;HFF + 组直径维持 200μm 以上(部分 1-2mm)，HFF - 组传代 3 后缩小，证实 HFF 提升类器官增殖能力、延长存活。

图3：HFF 对不同猫类器官的生长促进

猫 1(传代 8)、猫 2(传代 6)的 HFF + 组类器官数量多、体积大(直径 1mm)、无坏死，HFF - 组数量少、体积小且易坏死;4 只猫空肠类器官 100% 存活，回肠仅 1/3 存活，体现 HFF 作用的普适性(空肠)与组织特异性(回肠)。

图4：小鼠类器官对 HFF 响应弱于猫

HFF + 组小鼠类器官数量仅传代 19 略高，无显著差异;仅回肠类器官直径在 HFF + 组显著增大，空肠无差异，说明小鼠类器官无需 HFF 即可存活，对 HFF 响应远弱于猫。

图5：HFF 去除后的类器官存活

猫 0、3 类器官传代 12 或 17 去 HFF：传代 12 去 HFF 的回肠类器官传代 22 时数量减少，传代 17 去 HFF 的空肠 / 回肠类器官传代 25 仍高数量，且回肠出现 “出芽表型”，提示后期去 HFF 更利于存活。

图6：猫类器官支持弓形虫前性发育

猫类器官单层(21 天)感染弓形虫后，GRA11b 与弓形虫共定位，小鼠类器官无 GRA11b;21 天猫类器官 GRA11b 阳性空泡比例(ME49 株 30%、TgShSp1 株 20%)高于 10 天的，证实成熟类器官支持弓形虫前性发育。

全文总结

本研究用 HFF 共培养解决猫小肠类器官培养难题：1)HFF 使空肠类器官存活最长 288 天(传代 45 次)，增大体积，空肠响应优于回肠;2)猫类器官依赖 HFF 启动生长，成熟后(传代 17 后)可脱离，小鼠类器官对 HFF 响应弱;3)培养 21 天的猫类器官单层支持弓形虫前性发育，GRA11b 阳性率高。该模型减少实验猫使用，为猫肠道病原体研究提供工具，也为其他难培养物种类器官提供参考。