Eomesodermin+CD4+T 细胞：治愈性免疫治疗的关键 “双功能” 细胞

1 型调节性 T 细胞(Tr1)是一类不表达 FoxP3 但可分泌 IL-10 的 CD4+T 细胞，在慢性感染、自身免疫病及器官移植中承担免疫耐受维持的核心功能。Eomes 作为关键转录因子，已被证实可促进 Tr1 细胞分化并减轻异基因骨髓移植(BMT)后的移植物抗宿主病(GVHD)，但 Eomes 在 Tr1 细胞分化的具体阶段、以及细胞治疗后 Tr1 细胞兼具的调节与杀伤功能的调控机制，长期存在空白。

此外，嵌合抗原受体 T 细胞(CAR-T)疗法虽为癌症治疗带来革命，但 CD4+CAR-T 细胞的功能异质性(促炎毒性与抗肿瘤活性的平衡)是制约疗效的关键。明确 Eomes 对 CD4+T 细胞(包括 Tr1 及 CAR-T)功能的调控作用，是填补免疫治疗靶点空白、实现 “疗效提升 + 毒性降低” 双重目标的核心科学问题。

这篇发表在《Immunity》上的文章，首次揭示了 Eomes 驱动 CD4+T 细胞向 Tr1 细胞分化的完整轨迹(从 Eomes+IL-10 - 前体到 Eomes+IL-10 + 成熟 Tr1)，证实 Eomes+CD4+T 细胞兼具免疫调节与细胞毒性的 “双功能” 特性：一方面可通过分泌 IL-10 抑制过度炎症、减轻细胞因子释放综合征(CRS)，另一方面可通过穿孔素 / 颗粒酶及 Fas/FasL 通路介导抗肿瘤杀伤;在 CAR-T 治疗中，Eomes+CD4+CAR-T 细胞可维持长期持久性并控制肿瘤复发，且在长期缓解的淋巴瘤患者体内稳定存在(占 CD4+CAR-T 细胞的 40%-80%)。该发现为优化免疫治疗方案提供了全新细胞与分子靶点。

实验方法

本研究采用 “临床问题 - 小鼠模型 - 机制验证 - 临床样本回溯” 的闭环设计，核心实验流程分为 4 步，覆盖表型分析、功能验证与临床转化：

1.实验模型构建与样本采集：构建 Eomes 条件性敲除(Cd4cre+xEomesfl/fl)、IL-10/IFNγ 双报告(HULK)等基因修饰小鼠模型，建立异基因 BMT 及 CD19 靶向 CAR-T 治疗的白血病小鼠模型;同时收集 13 例接受 CD19 CAR-T 治疗的 B 细胞淋巴瘤患者的外周血样本，用于临床表型验证。

2.细胞表型与转录组分析：通过流式细胞术(含 FlowSOM 高维分析)、单细胞 / 批量 RNA 测序(scRNA-seq/bulk RNA-seq)、伪时间轨迹分析，解析 Eomes+CD4+T 细胞的分化阶段、分子标记(TIGIThiDNAM-1lo)及核心通路;利用逆转录病毒过表达 Eomes，验证其对细胞功能的直接调控作用。

3.体外功能验证：分离不同分化阶段的 Eomes+CD4+T 细胞，开展体外抑制实验(检测对效应 T 细胞增殖的抑制能力)、细胞毒实验(检测对白血病细胞的杀伤活性)，明确其免疫调节与抗肿瘤功能的物质基础(IL-10、穿孔素 / 颗粒酶)。

4.体内功能验证：在 BMT 模型中评估 Eomes+CD4+T 细胞的移植物抗白血病(GVL)效应与抗炎作用;在 CAR-T 治疗模型中验证 Eomes 对 CAR-T 细胞毒性、持久性及 CRS 的调控;通过竞争性移植实验明确 Fas/FasL 通路的协同杀伤作用。

关键结果

图1：Eomes+CD4+T 细胞兼具调节、细胞毒与耗竭样转录特征

该结果通过批量及单细胞 RNA 测序解析了 BMT 后供体 CD4+T 细胞的转录组图谱。研究将 CD4+T 细胞分为 Eomes-IL-10-(P1)、Eomes+IL-10-(P2)、Eomes+IL-10+(P3)三群，发现 Eomes + 亚群(P2、P3)随分化进程逐步上调效应分子(Prf1、Gzmk)、耗竭相关基因(Tox、Lag3)及调节性细胞因子(Il10)，同时下调祖细胞标记(Tcf7、Il7r);伪时间分析证实分化轨迹为 P1→P2→P3，且 Eomes 与 Il10 表达随分化逐步升高，而 Tcf7 表达持续降低。基因集富集分析(GSEA)进一步显示，P3 亚群显著富集 Tr1 细胞、CD4 细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)及耗竭 T 细胞通路，证实 Eomes+CD4+T 细胞的 “双功能” 转录基础。

图2：Eomes 驱动 Tr1 分化并可通过 TIGIT/DNAM-1 表型识别

该结果通过流式高维分析验证了转录组发现的表型特征。FlowSOM 聚类显示，Eomes+CD4+T 细胞高表达 TIGIT、PD-1、CD39 等共抑制分子，低表达活化受体 DNAM-1，呈现 TIGIThiDNAM-1lo 表型;Eomes 条件性敲除后，该表型细胞比例显著降低，且无法从 Eomes+IL-10 - 前体分化为 Eomes+IL-10 + 成熟 Tr1;在 HULK 报告小鼠中，IFNγ+IL-10 + 的功能性 Tr1 细胞均局限于 TIGIThi 亚群，且该亚群对 CD19 + 靶细胞的杀伤能力显著高于 TIGITlo 亚群，证实 TIGIT/DNAM-1 可作为 Eomes + 功能 Tr1 细胞的特异性标记。

图3：Eomes+CD4+T 细胞可独立于 IL-10 发挥抑制作用并清除抗原提呈细胞

该结果明确了 Eomes+CD4+T 细胞免疫调节功能的物质基础。体外实验显示，Eomes+IL-10 - 前体(P2)虽不分泌 IL-10，但因高表达穿孔素 / 颗粒酶，对效应 T 细胞的抑制能力介于 P1 与 P3 之间;过表达 Eomes 可显著增强 CD4+T 细胞的细胞毒分子表达及抑制活性，且抑制效果优于 FoxP3+Treg;体内实验中，Eomes 敲除的 CD4+T 细胞因穿孔素表达不足，无法清除 CD11c + 树突状细胞，导致小鼠出现噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)样脾肿大及红细胞异常聚集，证实 Eomes 通过调控穿孔素介导抗原提呈细胞清除，维持免疫稳态。

图4：Eomes+CD4+T 细胞介导 GVL 效应并限制过度炎症

该结果在 BMT 模型中验证了 Eomes+CD4+T 细胞的体内双重功能。体内杀伤实验显示，Eomes 敲除的 CD4+T 细胞对宿主 CD19+B 细胞的杀伤能力显著降低，导致 T 细胞嵌合率异常、白血病复发率升高，小鼠生存率显著下降;同时，Eomes 缺失会引发严重的全血细胞减少、脾组织细胞增生，表现为 HLH 样炎症表型，证实 Eomes+CD4+T 细胞是 BMT 后介导 GVL 效应、防止过度炎症的核心细胞群。

图5：Eomes 调控 CD4+CAR-T 细胞的细胞毒功能与肿瘤控制

该结果明确了 Eomes 在 CAR-T 治疗中的关键作用。在 CD19 靶向 CAR-T 治疗模型中，Eomes+CD4+CAR-T 细胞高表达穿孔素 / 颗粒酶 B，而 Eomes 敲除后，双阳性细胞比例近乎消失，CAR-T 细胞对白血病细胞的体外 / 体内杀伤能力显著减弱;进一步实验证实，Eomes 还可通过增强 Fas/FasL 通路协同杀伤靶细胞，且 Eomes 或穿孔素敲除的 CAR-T 细胞会导致 CD19 低表达白血病细胞逃逸，小鼠生存期显著缩短，证实 Eomes 是 CD4+CAR-T 细胞抗肿瘤功能的核心调控因子。

图6：Eomes+CD4+CAR-T 细胞呈 Tr1 样表型并控制 CRS

该结果揭示了 Eomes+CD4+CAR-T 细胞的抗炎作用及机制。Eomes 敲除的 CD4+CAR-T 细胞输注小鼠后，会出现更严重的临床症状及更高水平的 CRS 相关细胞因子(IL-6、TNF、MCP-1);HULK 报告小鼠证实，野生型 CD4+CAR-T 细胞中多数 IFNγ+ 细胞同时分泌 IL-10，呈典型 Tr1 表型;IL-10 敲除的 CAR-T 细胞会导致血浆 IL-6 水平显著升高，而穿孔素敲除无此效应，证实 Eomes+CAR-T 细胞通过 IL-10 抑制单核细胞来源的 IL-6，从而减轻 CRS。此外，Eomes 敲除会导致 CAR-T 细胞早期过度扩增但长期持久性下降，证实其对 CAR-T 细胞命运的双向调控。

图7：Eomes+CD4+CAR-T 细胞在长期缓解患者体内稳定存在

该结果完成了从基础研究到临床样本的回溯验证。将人 CD4+CAR-T 细胞的核心基因集投射到小鼠 UMAP 图谱，发现其与小鼠 Eomes+Tr1 细胞高度富集;在接受 CD19 CAR-T 治疗的淋巴瘤患者体内，CD4+CAR-T 细胞高表达 Eomes 及 Tr1 相关标记(IL-10、IFNγ、穿孔素)，且随时间推移，Eomes 表达稳定而 T-bet 表达下调，与小鼠模型表型一致;在生存期超 180 天的患者体内，Eomes+CD4+CAR-T 细胞占比维持在较高水平，证实其与长期缓解密切相关。

全文总结

本研究以 Eomes 为核心切入点，系统解析了 CD4+T 细胞向 Tr1 细胞分化的完整轨迹，首次明确了 Eomes+CD4+T 细胞 “调节 - 杀伤” 的双功能特性：在分化层面，Eomes 驱动细胞从祖细胞状态逐步获得耗竭样表型、调节性细胞因子及细胞毒分子;在功能层面，其既可通过 IL-10 抑制过度炎症、缓解 CRS，又可通过穿孔素 / 颗粒酶及 Fas/FasL 通路介导抗肿瘤杀伤;在 CAR-T 治疗中，Eomes 不仅维持 CD4+CAR-T 细胞的长期持久性，还可平衡治疗疗效与毒性。该研究打破了 “调节性 T 细胞无杀伤功能” 的传统认知，阐明了 Eomes 在免疫治疗中的核心调控作用，为优化细胞治疗方案、开发靶向 Eomes 的联合疗法提供了关键理论与实验依据。