SFRP2 单克隆抗体通过重塑肿瘤相关巨噬细胞抑制三阴性乳腺癌生长与转移

三阴性乳腺癌(TNBC)缺乏有效靶向治疗，化疗易耐药且转移率高，预后差。分泌型卷曲相关蛋白 2(SFRP2)在 TNBC 中高表达，与肿瘤血管生成、转移及免疫抑制相关，但针对 SFRP2 的免疫调节机制尚未明确。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在 TNBC 微环境中占比高，M2 型 TAMs 促进肿瘤进展，而 M1 型具有抗肿瘤活性，调节 TAM 极化是潜在治疗方向。

来自美国南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心外科、治疗生物化学与分子生物学系发表题为《Secreted frizzled-related protein 2 monoclonal antibody-mediated IFN-γ reprograms tumor-associated macrophages to suppress triple negative breast cancer》(SFRP2 单克隆抗体介导 IFN-γ 重编程肿瘤相关巨噬细胞以抑制三阴性乳腺癌)的文章，开发了人源化 SFRP2 单克隆抗体(hSFRP2 mAb)，通过重编程肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、上调 IFN-γ 表达、增加 M1/M2 巨噬细胞比例，显著抑制三阴性乳腺癌(TNBC)的原发肿瘤生长和肺转移，诱导多柔比星耐药 TNBC 细胞凋亡，且具有肿瘤特异性生物分布，为 TNBC 提供了新的靶向治疗策略。

实验方法

1.表达与定位检测：通过组织芯片(TMA)和多重免疫组化(IHC)，检测人 TNBC 样本中 SFRP2 和 CD38 的表达与共定位;利用 Western blot 验证 TNBC 细胞系(PY8119、E0771.LMB、MDA-MB-231)中两者的表达;分析 TCGA 数据库中 1075 例乳腺癌患者的 SFRP2 与 IFN-γ mRNA 相关性。

2.TAMs 分离与功能验证：从 E0771.LMB 原位肿瘤中分离 TAMs，经 hSFRP2 mAb 或 IgG1 对照处理后，通过 Western blot 和 qRT-PCR 检测 IFN-γ 的蛋白与 mRNA 水平;将处理后的 TAMs 与脾脏 T 细胞共培养，流式细胞术检测 T 细胞增殖标志物(CD25、CD69)。

3.动物模型实验：构建 TNBC 转移模型(尾静脉注射 E0771.LMB 或 PY8119 细胞)和原位模型(乳腺脂肪垫注射 MDA-MB-231 细胞)，给予 hSFRP2 mAb 或 IgG1 对照治疗，计数肺转移灶、测量肿瘤体积;通过 IHC 检测转移灶中 M1/M2 比例、凋亡细胞(TUNEL assay)及 HIF-1α 表达;ELISA 检测血清 IFN-γ 水平。

4.化疗耐药细胞系实验：通过逐步提高多柔比星浓度构建 MDA-MB-231 耐药细胞系(Doxo-R);分别用 hSFRP2 mAb、多柔比星或对照处理野生型(WT)和 Doxo-R 细胞，通过凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。

5.生物分布检测：向肿瘤 - bearing 和非肿瘤 - bearing 裸鼠注射近红外(NIR)标记的 hSFRP2 mAb 或 IgG1，通过活体成像和器官荧光定量，分析抗体在体内的分布特异性。

关键结果

图1：TNBC 肿瘤样本和细胞系表达 SFRP2 与 CD38，造血细胞仅表达 CD38

对含 88 个核心(44 例患者)的人类乳腺癌组织芯片(TMA)进行 IHC 分析，显示 SFRP2 和 CD38 在 TNBC、激素受体阳性及 Her2 阳性乳腺癌中均有表达，各亚型间无统计学差异(ANOVA，p=NS);Western blot 证实 PY8119、EO771.LMB、MDA-MB-231 三种 TNBC 细胞系均共表达 SFRP2 与 CD38;人类蛋白质图谱数据显示，CD38 在正常造血细胞(B 细胞、T 细胞、粒细胞等)中高表达，而 SFRP2 在这些细胞中几乎无表达，提示靶向 SFRP2 可特异性降低肿瘤微环境中 CD38 水平，且不影响正常造血细胞功能。

图2：多重 IHC 分析显示 SFRP2 与 CD38 在 TNBC 肿瘤微环境中共定位

对 4 例人类 TNBC 样本进行多重 IHC 染色(标志物包括 SFRP2、CD38、CD68、CD3、细胞角蛋白、CD19)，空间分析显示 SFRP2 在肿瘤细胞(87.57%±8.11%)、TAMs(90.34%±5.59%)、TILs(96.38%±2.21%)和 B 细胞(91.98%±7.72%)中高定位，CD38 与 SFRP2 的共定位率达 98.15%±1.35%，CD38 在上述细胞中的阳性率分别为 39.75%±20.17%、43.16%±14.94%、43.36%±9.05% 和 42.38%±19.48%，代表性图像清晰展示了 SFRP2、CD38 与细胞特异性标志物在肿瘤组织、TAMs 及 TILs 中的共定位(黄色 / 绿色标记)。

图3：SFRP2 单克隆抗体处理与 TAMs 中 IFN-γ 水平升高及 T 细胞增殖显著增强相关

从 EO771.LMB 原位肿瘤中富集的 TAMs 经 10μM hSFRP2 mAb 处理后，IFN-γ 蛋白水平在 1 小时和 24 小时分别升高 1.71 倍和 2.19 倍，mRNA 水平升高 2.35±0.08 倍(n=3，p<0.02);对 TCGA 数据库 1075 例乳腺癌样本的分析显示，SFRP2 与 IFN-γ mRNA 表达呈显著负相关(p<0.0001);TAMs 经 hSFRP2 mAb 预处理后与 T 细胞共培养，T 细胞表面早期增殖标志物 CD25 + 比例从 9.33±0.15% 升至 16.2±1.02%，晚期标志物 CD69 + 比例从 9.2±0.32% 升至 18.9±2.43%(均 n=3，p<0.05)，证实抗体可通过重编程 TAMs 激活 T 细胞增殖。

图4：hSFRP2 单克隆抗体的生物分布显示其优先定位于肿瘤组织

对荷 MDA-MB-231 肿瘤裸鼠尾静脉注射 NIR 标记的 hSFRP2 mAb，活体成像显示 24 小时时抗体在肝脏、膀胱和肿瘤中均有荧光分布，72 小时后肝脏中荧光消散，肿瘤中荧光持续存在(与抗体 4.1 天半衰期一致)，非荷瘤鼠无肿瘤部位特异性荧光;IgG1 对照组抗体在各器官中均匀分布，无肿瘤优先摄取;器官切除后定量显示，荷瘤鼠肿瘤中荧光强度显著高于其他器官，且 hSFRP2 mAb 在脂肪、心脏、肺等器官中的荧光水平显著低于 IgG1 对照组(p<0.05 至 p<0.001)，证实其肿瘤特异性分布特征。

图5：SFRP2 单克隆抗体治疗减少转移灶数量，增加肿瘤凋亡、M1/M2 TAM 比例及 IFN-γ 水平

在 EO771.LMB 转移模型中，hSFRP2 mAb 治疗组肺转移灶数量从 8.9±2.8 个降至 4.9±1.1 个(n=15，p<0.05)，凋亡细胞数从 9.8±1.8 个 / 高倍视野升至 21.0±4.6 个(p<0.01);PY8119 转移模型中，抗体组转移灶显著减少(n=11，p<0.05)，凋亡率显著升高(n=10，p=0.001);EO771 和 PY8119 模型中，抗体处理后肺转移灶的 M1/M2 TAM 比例分别从 1.05±0.07 升至 1.56±0.08(p=0.028)和 0.42±0.18 升至 1.15±0.15(p=0.036);ELISA 显示两模型中抗体治疗组血清 IFN-γ 水平均显著升高(p<0.0001)。

图6：SFRP2 单克隆抗体通过影响缺氧抑制 TNBC 肿瘤生长，诱导多柔比星敏感和耐药 MDA-MB-231 细胞凋亡

在 MDA-MB-231 原位模型中，hSFRP2 mAb 治疗 78 天后，肿瘤体积从 2998mm³ 降至 1159mm³，减少 61%(n=9 vs n=10，p<0.001)，治疗期间无明显毒性(体重无下降);肿瘤组织中 HIF-1α 阳性细胞比例从 30.11% 降至 14.98%(p=0.011);多柔比星耐药(Doxo-R)MDA-MB-231 细胞对 10μM 多柔比星无响应，而 hSFRP2 mAb 可显著诱导 WT 和 Doxo-R 细胞凋亡(n=6，p<0.0001)，证实其对化疗耐药 TNBC 仍有效。

全文总结

该研究首次证实 hSFRP2 mAb 通过重编程肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)发挥抗 TNBC 作用，核心机制为诱导 TAMs 分泌 IFN-γ，上调 M1/M2 比例，激活抗肿瘤免疫微环境。hSFRP2 mAb 具有三大核心优势：一是肿瘤特异性生物分布，降低脱靶毒性;二是同时抑制 TNBC 原发灶生长和肺转移，解决 TNBC 转移致死的关键问题;三是有效诱导多柔比星耐药细胞凋亡，突破化疗耐药瓶颈。