基于阳离子三酰脂质的 mRNA 脂质复合物实现肿瘤细胞高效 mRNA 转染

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：Effective mRNA transfection of tumor cells using cationic triacyl lipid‑based mRNA lipoplexes

中文标题：基于阳离子三酰脂质的 mRNA 脂质复合物实现肿瘤细胞高效 mRNA 转染

发表期刊：《BIOMEDICAL REPORTS》

影响因子：1.9

作者单位：

Department of Molecular Pharmaceutics, Hoshi University, Shinagawa, Tokyo 142‑8501, Japan

作者信息：

YOSHIYUKI HATTORI

研究背景

mRNA 可在细胞质中快速翻译表达治疗性蛋白，在疫苗研发、细胞重编程等生物医药领域具有重要应用价值，但 mRNA 自身稳定性差、跨细胞膜转运能力极低，必须依赖高效递送载体才能发挥作用;阳离子脂质体是目前最具应用前景的非病毒 mRNA 递送载体之一，传统薄膜水合法(TFH)制备阳离子脂质体及 mRNA 脂质复合物需经过脂质薄膜制备、水合、超声、挤出等繁琐步骤，耗时且依赖专用设备，而改良乙醇注射法(MEI)可通过一步混合脂质乙醇溶液与含 mRNA 的 PBS 溶液快速制备复合物，无需提前制备脂质体，操作更简便;前期研究已证实由三酰阳离子脂质 TC‑1‑12、中性脂质 DOPE 与分散剂 PEG‑Chol 组成的阳离子脂质体，在 HeLa 细胞中表现出优异的 mRNA 转染效率，本研究旨在通过对比 MEI 与 TFH 两种制备方法、优化复合物正 / 负电荷比，进一步明确 TC‑1‑12 基 mRNA 脂质复合物的最优制备条件，系统评估其在不同肿瘤细胞中的转染效率、细胞毒性、细胞摄取能力及储存稳定性，为该载体的体外及体内应用提供完整实验依据。

研究方法

本研究选用三酰阳离子脂质 TC‑1‑12 为核心载体材料、DOPE 为中性辅助脂质、PEG‑Chol 为分散剂，分别采用改良乙醇注射法(MEI)和薄膜水合法(TFH)，按 1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1 的正 / 负电荷比(TC‑1‑12 季胺基团与 mRNA 磷酸基团摩尔比)制备荧光素酶(FLuc)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及 Cy5 荧光标记的 mRNA 脂质复合物;利用动态光散射仪检测复合物的粒径、多分散系数(PDI)与 ζ 电位，选用人宫颈癌 HeLa 细胞、人前列腺癌 PC‑3 细胞、人肝癌 HepG2 细胞为实验细胞模型，通过化学发光仪检测 FLuc 活性、荧光显微镜与流式细胞术评估 EGFP 表达率及 Cy5 标记 mRNA 的细胞摄取效率，采用 CCK‑8 试剂盒检测复合物对细胞的毒性作用，将脂质乙醇溶液分别置于‑20℃、4℃、37℃条件下储存 4 个月后，检测其制备的复合物粒径及转染效率变化，所有实验数据均采用 GraphPad Prism 软件进行独立样本 t 检验或单因素方差分析 + Tukey 事后检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图 1 TC‑1‑12、DOPE 及 PEG‑Chol 的化学结构

本图展示了实验所用三种核心脂质的分子结构，其中 TC‑1‑12 是带有三酰基链的季铵盐型阳离子脂质，具备强膜融合能力与 mRNA 结合能力，DOPE 作为中性辅助脂质可提升脂质复合物的膜融合效率与胞内释放能力，PEG‑Chol 作为分散剂能抑制复合物聚集、维持体系均匀稳定，三种脂质的分子结构特性共同决定了 mRNA 脂质复合物的递送性能，是后续实验的物质基础。

图 2 电荷比对 HeLa 细胞 FLuc 表达活性的影响

本图探究了不同制备方法与电荷比对 mRNA 转染后蛋白表达的影响，MEI 法制备的复合物在电荷比 3:1 时 FLuc 表达活性达到峰值，TFH 法则在电荷比 4:1 时表达量最高，且 MEI 法 3:1 组的表达量显著高于 TFH 法 4:1 组，约为商用 Lipofectamine MessengerMAX 的 1/2;空白脂质体对照组无 FLuc 表达，证明蛋白表达完全依赖 mRNA 转染，该结果直接证实 MEI 法能更高效地介导 mRNA 进入细胞并表达目的蛋白。

图 3 电荷比对 HeLa 细胞毒性的影响

该图揭示了复合物电荷比与细胞毒性的关联，两种方法制备的复合物细胞毒性均随电荷比升高而增强，ζ 电位越高毒性越显著;MEI 法 3:1 最优转染条件下细胞活力为 46%，TFH 法 4:1 最优条件下细胞活力为 57%，二者均远高于商用 Lipofectamine MessengerMAX 的 22% 细胞活力，说明 TC‑1‑12 基 mRNA 脂质复合物的细胞安全性显著优于商用转染试剂，具备更低的细胞损伤风险。

图 4 电荷比对 HeLa 细胞 EGFP 表达的影响

本图从荧光蛋白表达层面验证转染效率，MEI 法在 2:1‑4:1 电荷比范围内，EGFP 阳性细胞率达 71%‑83%，与商用 Lipofectamine MessengerMAX 的 81% 转染效率相当;TFH 法在所有测试电荷比下 EGFP 阳性细胞率仅为 58%‑74%，显著低于 MEI 法，荧光显微镜下也可观察到 MEI 法组细胞荧光强度更高、阳性细胞更多，直观证明 MEI 法制备的复合物能实现更广泛的细胞转染。

图 5 HeLa 细胞对 mRNA 脂质复合物的摄取效率

本图解析了 MEI 法高转染效率的内在机制，选用 MEI 法 3:1、TFH 法 4:1 最优转染条件，通过 Cy5 标记 mRNA 检测细胞摄取，结果显示 MEI 法组细胞内荧光信号强度显著高于 TFH 法组与商用试剂组，流式细胞术定量结果也证实 MEI 法组的几何平均荧光强度更高;游离 mRNA 组无细胞摄取，说明复合物是 mRNA 进入细胞的必要载体，且复合物摄取效率与 FLuc 表达水平呈正相关，证明 MEI 法提升转染效率的核心原因是增强了细胞对 mRNA 复合物的摄取能力。

图 6 脂质乙醇溶液储存对 HeLa 细胞 FLuc 表达的影响

本图验证了储存稳定性对转染效率的影响，经‑20℃、4℃、37℃储存 4 个月的脂质乙醇溶液，制备的 mRNA 脂质复合物转染 HeLa 细胞后，FLuc 表达活性与新鲜制备组无显著差异，即便 37℃高温储存也未降低转染效率，打破了传统脂质制剂需低温保存的限制，证明该脂质乙醇溶液可在室温甚至高温条件下长期稳定保存，极大提升了临床应用与储存的便利性。

图 7 PC‑3 细胞中 mRNA 脂质复合物的蛋白表达与细胞毒性

本图将载体拓展至人前列腺癌 PC‑3 细胞，MEI 法 3:1 复合物的 FLuc 表达活性虽低于商用 Lipofectamine MessengerMAX，但仍可实现有效的 EGFP 荧光表达;细胞毒性检测显示该复合物组细胞活力高达 103%，无明显细胞毒性，而商用试剂组细胞活力仅为 72%，证明该载体在 PC‑3 细胞中具备低毒高效的转染特性，安全性优势突出。

图 8 HepG2 细胞中 mRNA 脂质复合物的蛋白表达与细胞毒性

本图在难转染的人肝癌 HepG2 细胞中验证载体性能，MEI 法 3:1 复合物仍可介导 mRNA 有效表达，FLuc 活性与 EGFP 荧光均呈阳性;细胞活力检测结果为 81%，显著高于商用 Lipofectamine MessengerMAX 的 70%，说明该载体对难转染肿瘤细胞同样具备良好的转染能力与低毒性，适配多种肿瘤细胞模型的 mRNA 递送需求。

研究结论

本研究系统对比了改良乙醇注射法(MEI)与薄膜水合法(TFH)制备 TC‑1‑12 基 mRNA 脂质复合物的性能，确定 MEI 法在正 / 负电荷比 3:1 时为最优制备条件，该条件下制备的复合物粒径小、均一性好、细胞摄取效率高，在 HeLa、PC‑3、HepG2 三种肿瘤细胞中均能高效介导 FLuc、EGFP 等目的蛋白表达，细胞毒性显著低于商用 Lipofectamine MessengerMAX 转染试剂;同时用于制备复合物的脂质乙醇溶液可在‑20℃、4℃、37℃条件下稳定储存 4 个月，转染效率不受储存温度与时间影响，且 MEI 法无需专用设备、一步即可完成复合物制备，操作简便高效，整体而言 TC‑1‑12 基 mRNA 脂质复合物兼具制备便捷、储存稳定、低毒性、高转染效率的优势，为体外肿瘤细胞 mRNA 转染及未来体内 mRNA 递送应用提供了一种安全高效的非病毒载体方案。