MMPP 通过抑制 MD2 依赖的 NF-κB 和 JNK/AP-1 通路在 THP-1 单核细胞中发挥抗炎作用

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：MMPP Exerts Anti-Inflammatory Effects by Suppressing MD2-Dependent NF-κB and JNK/AP-1 Pathways in THP-1 Monocytes

中文标题：MMPP 通过抑制 MD2 依赖的 NF-κB 和 JNK/AP-1 通路在 THP-1 单核细胞中发挥抗炎作用

发表期刊：《Pharmaceuticals》

影响因子：4.8

作者单位：

Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul 05029, Republic of Korea

College of Pharmacy and Medical Research Center, Chungbuk National University, Cheongju 28160, Republic of Korea

作者信息：

第一作者：Seonhwa Kim

通讯作者：Do-Young Yoon

研究背景

单核细胞是先天免疫核心细胞，在脂多糖(LPS)刺激下可大量释放促炎因子与炎症介质，引发过度炎症反应，参与脓毒症、急性肺损伤、自身免疫病等多种炎症疾病进程;LPS 作为革兰氏阴性菌外膜成分，通过CD14-MD2-TLR4轴激活下游信号，其中髓系分化蛋白 2(MD2)是 TLR4 识别 LPS 的必需共受体，LPS 结合 MD2 后诱导 TLR4 二聚化，进而激活NF-κB与JNK/AP-1两大核心炎症通路，驱动 TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 等促炎因子高表达;(E)-2 - 甲氧基 - 4-[3-(4 - 甲氧基苯基) 丙 - 1 - 烯 - 1 - 基] 苯酚(MMPP)是新型合成小分子化合物，为 BHPB 的稳定类似物，前期研究证实其可通过下调 STAT3 通路发挥抗炎、抗癌作用，也可作为 PPARγ 激动剂改善胰岛素抵抗，但MMPP 能否作为 MD2 拮抗剂、阻断 LPS/TLR4 下游炎症信号尚未阐明;本研究以 LPS 诱导的 THP-1 单核细胞炎症模型为对象，探究 MMPP 的抗炎效应与分子机制，明确其对 CD14/MD2 结合、NF-κB 与 JNK/AP-1 通路活化、促炎因子表达的调控作用，为开发靶向 MD2/TLR4 的新型抗炎药物提供实验依据。

研究方法

本研究选用人单核细胞系 THP-1 为研究模型，在含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中、37℃、5% CO₂条件下培养;采用 MTS 法检测不同浓度 MMPP(2、4μg/mL)单独或联合 LPS(1μg/mL)处理 24h 后的细胞活力，确定无毒性作用浓度;THP-1 细胞经 MMPP 预处理 1h 后加 LPS 刺激 2h，通过 RT-qPCR 检测促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 及炎症介质 COX-2 的 mRNA 水平;LPS 刺激 30min/45min/90min 后收集细胞，通过 Western blot 检测 IKKα/β、IκBα 的磷酸化水平，分离胞浆与胞核蛋白检测 NF-κB p50/p65、AP-1 c-Jun/c-Fos 的核转位水平;利用免疫荧光染色观察 NF-κB p50 与 c-Jun 的核内定位;采用 PyRx、AutoDock Vina、PyMOL、LigPlot + 软件进行分子对接分析，预测 MMPP 与 CD14(PDB：4GLP)、MD2(PDB：2E59)的结合能力与作用位点;通过体外结合实验验证 MMPP 对生物素标记 LPS 与重组 MD2(rMD2)结合的竞争性抑制作用;所有实验独立重复 3 次，数据以均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析 + Tukey 检验，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001 为差异具有统计学意义。

实验结果

图 1 MMPP 的化学结构与细胞毒性检测

本图确定 MMPP 的安全作用浓度。A 图展示 MMPP 的化学结构，为 BHPB 的稳定合成类似物;B 图 MTS 细胞活力实验显示，2、4μg/mL MMPP 单独处理或联合 1μg/mL LPS 处理 THP-1 细胞 24h，细胞活力均无显著变化，无明显细胞毒性，确定 2、4μg/mL 为后续实验的安全作用浓度。

图 2 MMPP 对 LPS 诱导的促炎因子与介质 mRNA 表达的抑制作用

本图证实 MMPP 可显著抑制 LPS 诱导的炎症基因转录。THP-1 细胞经 MMPP 预处理 1h 后加 LPS 刺激 2h，RT-qPCR 结果显示，LPS 显著上调 TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 的 mRNA 水平;MMPP 以剂量依赖方式显著抑制上述基因的表达，4μg/mL MMPP 的抑制效果显著优于 2μg/mL，证明 MMPP 可在转录水平阻断 LPS 诱导的炎症反应。

图 3 MMPP 对 LPS 诱导的 NF-κB 通路活化的抑制作用

本图明确 MMPP 通过调控 IKK/IκBα 磷酸化阻断 NF-κB p50 核转位。A 图 Western blot 显示，LPS 显著诱导 IKKα/β 磷酸化，MMPP 剂量依赖性抑制 p-IKKα/β 水平;B 图显示 MMPP 显著抑制 IκBα 的磷酸化与降解，维持 IκBα 对 NF-κB 的胞内滞留;C 图核浆分离实验显示，LPS 显著促进 NF-κB p50、p65 核转位，MMPP 仅显著抑制 p50 核转位，对 p65 无明显影响;D 图免疫荧光验证，LPS 诱导 p50 大量入核，MMPP 显著减少核内 p50 荧光信号，证实 MMPP 通过抑制 IKK/IκBα 通路特异性阻断 NF-κB p50 核转位。

图 4 MMPP 对 LPS 诱导的 JNK/AP-1 通路活化的抑制作用

本图揭示 MMPP 靶向抑制 JNK/AP-1 通路。A 图 MAPKs 磷酸化检测显示，LPS 显著上调 p38 与 JNK 磷酸化，对 ERK 无影响;MMPP 剂量依赖性抑制 p-JNK 水平，仅高浓度对 p-p38 有轻微抑制作用;B 图核浆分离实验显示，LPS 促进 c-Jun、c-Fos 核转位，MMPP 仅显著抑制 c-Jun 核转位;C 图免疫荧光验证，LPS 诱导 c-Jun 大量入核，MMPP 显著减少核内 c-Jun 荧光信号，证实 MMPP 通过抑制 JNK 磷酸化阻断 AP-1 c-Jun 核转位。

图 5 MMPP 直接结合 CD14 与 MD2 并竞争性抑制 LPS-MD2 结合

本图阐明 MMPP 抗炎的上游分子机制。A/B 图分子对接显示，MMPP 与 CD14 的结合亲和力为 - 7.6kcal/mol，通过疏水作用与 Ala48、Val52 等残基结合，与 Cys51 形成氢键;与 MD2 的结合亲和力为 - 7.3kcal/mol，结合于 MD2 疏水口袋，与 Ile32、Leu54、Phe121 等残基形成疏水作用，结合能力与阳性对照地塞米松(Dex)相当;C 图体外结合实验显示，MMPP 可显著竞争性抑制生物素 - LPS 与 rMD2 的结合，证明 MMPP 通过直接结合 CD14 与 MD2，阻断 LPS 对 MD2/TLR4 的激活。

图 6 MMPP 抗炎作用机制模式图

本图总结全文调控通路：MMPP 直接结合细胞膜上 CD14 与 MD2，竞争性阻断 LPS 与 MD2 的结合;进而抑制下游 IKKα/β/IκBα 磷酸化，阻止 NF-κB p50 核转位;同时抑制 JNK 磷酸化，阻止 AP-1 c-Jun 核转位;最终下调 TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 等促炎因子与介质的表达，在 THP-1 单核细胞中发挥抗炎作用。

研究结论

本研究证实新型小分子化合物 MMPP 在无细胞毒性浓度下，可通过直接靶向结合 CD14 与 MD2竞争性阻断 LPS 对 MD2/TLR4 复合物的激活，进而双重抑制下游 NF-κB 与 JNK/AP-1 两大炎症信号通路：一方面抑制 IKKα/β 磷酸化与 IκBα 降解，特异性阻断 NF-κB p50 核转位;另一方面抑制 JNK 磷酸化，阻断 AP-1 c-Jun 核转位;最终显著降低 LPS 诱导的促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 及炎症介质 COX-2 的转录与表达，在 THP-1 单核细胞中发挥强效抗炎作用;该研究首次揭示 MMPP 作为MD2 拮抗剂的全新抗炎机制，为脓毒症、急性炎症等疾病的治疗提供了新型候选药物与作用靶点。