先天免疫激活差异显著丨HDV 与动物 δ 样病毒的免疫逃逸新机制

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Woodchuck and deer Hepatitis Delta-like agents show distinct innate immune activation and IFN resistance compared to human Hepatitis D Virus

中文标题：土拨鼠与鹿类丁型肝炎样病毒相较人丁型肝炎病毒呈现独特的先天免疫激活与干扰素抗性

发表期刊：《Scientific Reports》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Heidelberg University, Medical Faculty Heidelberg, Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg, Germany

2.School of Public Health and Emergency Management, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, China

3.German Center for Infection Research (DZIF), Partner Site Heidelberg, Heidelberg, Germany

作者信息：

第一作者：Gnimah Eva Gnouamozi

通讯作者：Stephan Urban

研究背景

人丁型肝炎病毒(HDV)是一类缺陷型卫星病毒，需依赖乙肝病毒(HBV)包膜蛋白完成包装传播，其复制可被模式识别受体 MDA5 与 LGP2 感知并激活干扰素(IFN)应答;IFN(内源性诱导或外源性给药)能显著抑制 HDV 通过细胞分裂介导的传播(CDMS)，但对静息细胞内的病毒复制影响微弱，是 HDV 持续感染的关键机制。近年来多种动物源丁型肝炎样病毒(DLA)被发现，包括土拨鼠 δ 样病毒(WoDV)、鹿 δ 样病毒(DeDV)，归属于 Kolmioviridae 科，与 HDV 共享基因组结构、核酶、δ 抗原等核心特征，但天然辅助病毒尚不明确，且缺乏可模拟天然感染的体外模型，其与宿主先天免疫系统的互作机制、对 IFN 的敏感性、CDMS 调控模式均未被阐明。为填补这一研究空白，本研究构建基于 HBsAg 包膜蛋白的假病毒感染系统，实现 WoDV 与 DeDV 对人肝细胞系的有效感染，在免疫健全与免疫缺陷肝细胞模型中，系统对比 HDV、WoDV、DeDV 的先天免疫激活强度、IFN 对 CDMS 的调控效应、病毒抗原对 IFN 信号的影响，揭示非人类源 DLA 相较于 HDV 的独特免疫逃逸与 IFN 抗性表型，为 δ 病毒进化、持续感染机制及抗病毒药物研发提供全新认知。

研究方法

本研究选用 HuH7NTCP(免疫缺陷)、HepaRGNTCP(免疫健全)、土拨鼠肝癌 WCH17NTCP 细胞为体外模型，通过共转染 HDV/WoDV/DeDV 1.1 倍全长基因组质粒、HBsAg 表达质粒，反式互补 L-HDAg 质粒，制备 HBsAg 假型病毒颗粒并经肝素亲和层析纯化;以 MOI=1 对肝细胞系进行同步感染，以 NTCP 抑制剂 Bulevirtide(BLV)作为感染特异性对照;在感染后 3、6、9 天，通过免疫荧光(IF)检测病毒 δ 抗原(DAg)表达、RT-qPCR 定量细胞内病毒 RNA 与干扰素刺激基因(ISGs，RSAD2、Mx1)转录水平、共聚焦显微镜观察 DAg 与 Mx1 的细胞定位;构建 CDMS 检测体系，感染后 6 天细胞以高稀释比传代诱导克隆扩增，设置 IFN-α2A、IFN-λ1、泛物种 IFN-αA/D 处理组与 JAK 抑制剂 Ruxolitinib 对照组，通过 IF 定量 DAg 阳性细胞簇数量与大小、Northern blot 验证病毒 RNA 水平;构建 MDA5 敲除 HepaRGNTCP 细胞、稳定表达 WoDAg/DeDAg 的 HuH7 细胞、L-HDAg 缺陷型 HDV(HDV-ΔL)，探究病毒抗原与宿主受体对先天免疫感知的调控作用;所有实验独立重复≥3 次，数据以均值 ± 标准差表示，采用 Student’s t 检验与单因素方差分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图 1 HDV、WoDV、DeDV 在人源肝细胞系中的复制动力学

本图系统验证 HBsAg 假型病毒可成功介导 HDV、WoDV、DeDV 感染人肝细胞并启动有效复制。A 图展示假病毒制备流程：HuH7 细胞共转染病毒基因组与 HBsAg 质粒，3 天后补转 L-HDAg 实现 RNP 包装，收集上清纯化后感染靶细胞;B 图免疫荧光结果显示，HuH7NTCP 与 HepaRGNTCP 细胞中，三种病毒的 DAg 阳性细胞数量随感染时间延长逐步增加，HDV 在 6 天达到平台期，WoDV 与 DeDV 至 9 天仍持续上升，证明假病毒感染具有 NTCP 依赖性，BLV 处理可完全阻断感染;C 图 RT-qPCR 定量显示，细胞内病毒 RNA 水平与抗原表达趋势一致，WoDV 复制水平显著高于 HDV，DeDV 介于两者之间，证实 WoDV 与 DeDV 可在人源肝细胞中完成高效复制，且复制动力学与 HDV 存在明显差异。

图 2 HDV、WoDV、DeDV 在 HepaRGNTCP 细胞中诱导的先天免疫应答

本图揭示三种病毒激活先天免疫的强度存在显著差异。A 图为实验设计，以 MOI=1 感染免疫健全 HepaRGNTCP 细胞，BLV 组为对照;B 图 RT-qPCR 结果显示，感染后 6 天 HDV 显著诱导 RSAD2 高表达，WoDV 仅诱导微弱上调，DeDV 诱导水平介于两者之间，9 天无进一步升高，证明 WoDV 与 DeDV 激活 IFN 应答的能力远弱于 HDV;C 图免疫荧光共定位显示，Mx1 作为 ISG 标志物，在 HDV 感染细胞中 6 天达峰值，DeDV 组 6-9 天可检测到，WoDV 组仅微弱表达，且 Mx1 不仅在病毒阳性细胞中表达，还通过旁分泌 IFN 信号在邻近未感染细胞中激活，MDA5 敲除细胞中 DeDV 无法诱导 RSAD2 上调，证实 MDA5 是感知 DLA 复制的核心模式识别受体。

图 3 HDV、WoDV、DeDV 在 HuH7NTCP 与 HepaRGNTCP 细胞中的细胞分裂介导传播(CDMS)

本图明确先天免疫状态对三种病毒 CDMS 的调控差异。A 图为 CDMS 实验流程：感染后 6 天细胞高稀释传代，诱导克隆扩增后检测 DAg 阳性细胞簇;B 图荧光结果显示，免疫缺陷 HuH7NTCP 细胞中，三种病毒均形成大量大尺寸 DAg 阳性细胞簇，CDMS 可高效进行;免疫健全 HepaRGNTCP 细胞中，HDV 的 CDMS 被显著抑制，仅出现单个阳性细胞，而 WoDV 与 DeDV 仍能形成大量阳性细胞簇，CDMS 不受明显影响;C 图总结表型差异，证实 HDV 的 CDMS 受宿主先天免疫严格限制，而 WoDV 与 DeDV 可逃逸先天免疫介导的 CDMS 抑制，这一差异与三者的先天免疫激活强度直接相关。

图 4 IFN 处理对 HuH7NTCP 细胞中 WoDV 与 DeDV 的 CDMS 的影响

本图直接证实 WoDV 与 DeDV 的 CDMS 具有 IFN 抗性，而 HDV 对 IFN 高度敏感。A 图为实验设计：HuH7NTCP 细胞感染后传代，加入 IFN-α2A 处理，检测克隆扩增后的 DAg 簇;B 图荧光结果显示，IFN 处理后 HDV 的 DAg 阳性细胞簇完全消失，而 WoDV 与 DeDV 仍形成大量清晰的阳性簇;C 图定量分析显示，IFN 处理后 HDV 的簇数量与细胞数显著降低，WoDV 与 DeDV 无显著变化;D 图 Northern blot 验证，IFN 处理仅降低 HDV 的病毒 RNA 水平，对 WoDV 与 DeDV RNA 无明显影响;E 图共定位显示，WoDV 与 DeDV 感染细胞中 Mx1 高表达的同时，CDMS 仍正常进行，而 HDV 感染细胞中 Mx1 表达即伴随 CDMS 抑制，证明两种 DLA 可在 IFN 激活的抗病毒状态下维持细胞分裂传播。

图 5 WoDV 在土拨鼠源 WCH17NTCP 细胞中的 CDMS 对 IFN 的抗性

本图在天然宿主细胞模型中验证 WoDV 的 IFN 抗性表型具有跨宿主保守性。A 图显示 WoDV 可有效感染 WCH17NTCP 细胞，感染具有 NTCP 依赖性;B 图荧光结果显示，泛物种 IFN-αA/D 处理后，WoDV 的 DAg 阳性细胞簇数量与大小无显著变化，与人类细胞系结果一致;C 图定量分析证实，IFN 处理组与未处理组的簇数量、单个簇细胞数无统计学差异，证明 WoDV 在天然宿主土拨鼠肝细胞中，其 CDMS 同样不被 IFN 抑制，该抗性表型并非人源细胞特异性现象，而是病毒固有的进化特征。

图 6 L-HDAg 对 HDV 干扰素敏感性的影响

本图明确 HDV 的 IFN 敏感性不依赖 L-HDAg。A、D 图分别在 HepaRGNTCP 与 HuH7NTCP 细胞中感染野生型 HDV 与 HDV-ΔL;B、E 图显示，因缺失 L-HDAg 的复制抑制作用，HDV-ΔL 感染率显著高于野生型 HDV;C 图显示，在免疫健全 HepaRGNTCP 细胞中，HDV-ΔL 与野生型 HDV 的 CDMS 均被内源性 IFN 抑制，JAK 抑制剂 Ruxolitinib 可恢复其 CDMS;F 图显示，外源性 IFN 处理同样抑制 HDV-ΔL 的 CDMS，与野生型表型一致，证明 L-HDAg 并非调控 HDV 细胞分裂期 IFN 敏感性的关键因子，该表型由其他病毒或宿主因子介导。

研究结论

本研究成功构建 HBsAg 假型病毒感染系统，实现土拨鼠 δ 样病毒(WoDV)与鹿 δ 样病毒(DeDV)在人源及天然宿主肝细胞中的稳定复制，系统对比其与人丁型肝炎病毒(HDV)的先天免疫互作与干扰素敏感性;研究发现，WoDV 与 DeDV 在免疫健全肝细胞中诱导的 MDA5 依赖性 IFN 应答及 ISG 表达水平显著弱于 HDV，且二者通过细胞分裂介导的传播(CDMS)不受内源性先天免疫激活与外源性 IFN-α/λ 处理的抑制，该抗性表型在人源与土拨鼠源肝细胞中均保守存在;机制研究证实，WoDAg 与 DeDAg 不干扰 IFN 信号通路，HDV 的 L-HDAg 也不参与其 IFN 敏感性调控，排除病毒抗原为核心调控因子;整体结果揭示非人类源丁型肝炎样病毒进化出区别于 HDV 的先天免疫逃逸与 IFN 抗性策略，为理解 δ 病毒的进化多样性、持续感染机制及跨物种传播潜力提供了关键实验证据，也为广谱抗 δ 病毒药物研发提供了新的靶点方向。