螯合剂引导放射合成、临床前评估及[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)3用于正电子发射断层扫描成像的临床研究

基本信息

英文标题：Chelator-guided radiosynthesis, preclinical evaluation, and clinical study of [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)3 for positron emission tomography imaging

中文标题：螯合剂引导放射合成、临床前评估及[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)3用于正电子发射断层扫描成像的临床研究

发表期刊：《Journal of Controlled Release》

影响因子：11.5

作者单位：

陆军军医大学

第三军医大学等

作者信息：

Fangyang Wang, Yi Luo, Yueying Zhang, Xin Li, Zhipeng Wen, Qiang Wang, Weicheng Zhou, Yi Tang, Guo Xu, Kaijun Liu,* Jingchao Li,* Xiao Chen*

研究背景

研究背景：

1.成纤维细胞活化蛋白(FAP)在多种实体瘤的癌相关成纤维细胞(CAFs)中高表达，在健康组织中低表达，是理想的泛癌靶点。

2.基于FAP抑制剂(FAPI)的小分子PET探针(如[68Ga]Ga-FAPI-04)虽能有效勾画肿瘤，但因系统清除快、肿瘤滞留不足，治疗转化效果有限。

3.多聚化策略(如构建二聚体、三聚体FAPI衍生物)可显著增强肿瘤摄取和滞留，但现有研究对螯合剂优化关注不足。

4.TRAP螯合剂(三氮杂环壬烷-膦酸)比传统DOTA/NOTA具有更快的68Ga标记动力学和更宽pH范围的稳定性，但尚未用于设计FAPI多聚体探针。

5.研究创新点：首次将TRAP螯合剂与三聚体FAPI设计结合，开发出[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃，实现温和条件下高效标记、显著提升肿瘤摄取与滞留，并在临床患者中验证了优于[68Ga]Ga-FAPI-04和[18F]FDG的诊断效能。

研究方法

1.化学合成与标记：通过固相合成和点击化学制备TRAP-(FAPI)₃前体;使用68Ge/68Ga发生器，在40°C、pH≈2条件下5分钟完成标记，放射性化学产率>95%，经C8柱纯化。

2.计算分析：采用Materials Studio DMol3模块(PBE泛函、DNP基组)计算TRAP、DOTA、NOTA与Ga³⁺的结合能。

3.体外稳定性与亲脂性：在PBS和胎牛血清(FBS)中37°C孵育3h，HPLC检测放射化学纯度;采用异辛醇-PBS体系测定logD₇.₄。

4.细胞实验：Western blot和免疫细胞化学验证U87MG(FAP阳性)和A549(FAP阴性)细胞中FAP表达;细胞摄取、阻断和竞争结合实验测定IC₅₀。

5.动物模型：BALB/c裸鼠皮下接种U87MG或A549细胞构建荷瘤模型;小动物PET/CT显像(注射9.25 MBq，采集600s);生物分布研究(30、60、120、240min);尿液HPLC分析体内稳定性;KM小鼠毒性测试(肝肾功能指标)。

6.辐射剂量学：4名健康志愿者行PET显像(5个时间点)，PMOD软件勾画VOI，OLINDA/EXM计算吸收剂量和有效剂量。

7.临床PET/CT显像：9例不同癌症患者(食管癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌)接受[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃显像，部分患者同时行[68Ga]Ga-FAPI-04和[18F]FDG显像进行头对头比较。使用Siemens Biograph64扫描仪，注射111-185 MBq，静置40-60min后采集，延迟4h显像。

8.统计学分析：数据以均值±SD表示，组间比较采用Student's t检验，P<0.05为显著。

方案:通过螯合剂导向创新构建[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)3用于FAP阳性恶性肿瘤PET成像增强。

实验结果

图1. [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃的表征

A) [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃的化学结构(含三个FAPI基团连接于TRAP螯合剂)。

B) 不同螯合剂-Ga复合物的计算结合能：TRAP-Ga结合能显著高于DOTA-Ga和NOTA-Ga。

C) Radio-HPLC与UV-HPLC对比显示[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃与前体保留时间一致，标记成功。

D) [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃和[68Ga]Ga-FAPI-04的脂水分配系数(logD₇.₄)，两者均为亲水性(-2.71±0.19 vs -3.96±0.16)。

E) [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃在PBS和FBS中孵育3h，放射化学纯度>95%，体外稳定性优异。

图2. 细胞结合实验

A) Western blot检测U87MG(FAP高表达)和A549(FAP低表达)细胞中FAP蛋白水平。

B) 免疫细胞化学染色证实U87MG细胞FAP阳性，A549细胞FAP阴性(标尺=50 μm)。

C) U87MG细胞摄取实验：[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃的摄取在240min时达2.31±0.42%，显著高于[68Ga]Ga-FAPI-04(0.07±0.03%);加入过量FAPI-04阻断后摄取降至0.27±0.15%。

D) 竞争结合实验：未标记TRAP-(FAPI)₃竞争结合FAP，测得IC₅₀=2.18 nM，优于已报道的[68Ga]Ga-FAPI-04(7.36 nM)。

图3. 小鼠模型体内研究

A) U87MG荷瘤小鼠全身PET显像：[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃(黄箭)在30min即见高肿瘤摄取，4h仍清晰可见;[68Ga]Ga-FAPI-04(绿箭)早期摄取中等，随后快速清除。

B) 阻断实验：共注射未标记FAPI-04后，肿瘤摄取显著降低。

C) 肿瘤SUVmax定量比较：[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃在240min时达3.03±0.66%ID/g，而[68Ga]Ga-FAPI-04仅0.41±0.04%ID/g。

D) U87MG荷瘤小鼠生物分布：肾和肿瘤在30min高摄取，肿瘤滞留持久(240min时仍>2%ID/g)。

E) 尿液HPLC分析：[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃在体内3h后仍保持完整，代谢稳定性高。

图4. 健康志愿者[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃ PET显像与剂量学评估

A) 4名健康志愿者注射后不同时间点PET显像。

B) 靶器官不同时间点SUVmean值。

表1. [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃的剂量学评估报告(吸收剂量和有效剂量)。甲状腺吸收剂量最高(1.27E-01 mGy/MBq)，胰腺、红髓和甲状腺的有效剂量相对较高。

图5. 结直肠癌肝转移患者比较PET/CT显像

A) [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃早期(1h)和延迟(4h)显像：肝尾状叶转移灶(绿箭)SUVmax从7.44升至10.34，盆腔淋巴结(蓝箭)SUVmax从6.21升至8.30。

B) 同一患者1h时[68Ga]Ga-FAPI-04与[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃比较：后者在结肠恶性病变(黄箭)中SUVmax更高(8.17 vs 6.96)。

图6. 原发性肝癌患者头对头比较及组织学验证

A) 1h时[18F]FDG、[68Ga]Ga-FAPI-04和[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃ PET/CT显像比较：FAPI三聚体检测病灶最多(55个 vs FAPI-04的40个 vs FDG的36个)，原发灶SUVmax最高(10.54 vs 8.77 vs 3.92)。

B) 手术切除肿瘤组织的H&E染色和FAP免疫组化染色(标尺=200 μm)，证实FAP高表达。

研究结论

1.成功开发新型三聚体FAPI探针： [68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃利用TRAP螯合剂的多价结合位点，实现温和条件下高效标记(5min，>95%产率)。

2.显著提升靶向性能： 相比单体[68Ga]Ga-FAPI-04，三聚体在FAP阳性U87MG细胞中摄取更高(240min时2.31% vs 0.07%)，IC₅₀更低(2.18 nM vs 7.36 nM)，肿瘤滞留显著延长。

3.优越的体内显像效果： 在U87MG荷瘤小鼠中，肿瘤SUVmax在4h时为3.03%ID/g，远高于FAPI-04(0.41%ID/g);肿瘤/肌肉比达28.03，肿瘤/肝比达5.71。

4.临床验证诊断优势： 在9例癌症患者中，[68Ga]Ga-TRAP-(FAPI)₃检测病灶数多于FAPI-04和FDG，且在延迟显像中SUV持续升高，展示出卓越的诊断灵敏度。

5.安全性良好： 急性毒性实验显示肝肾功能指标无显著变化;健康志愿者剂量学评估显示有效剂量在可接受范围(甲状腺、胰腺等器官摄取相对较高需注意)。

6.首次应用TRAP于FAPI探针： 该工作为TRAP基多聚体FAPI放射药物的开发提供了通用平台，并展望了其用于治疗性核素(⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁴⁷Sc)标记或激活响应型纳米药物的潜力。

文献意义

本研究是首个将TRAP螯合剂用于设计FAPI多聚体PET探针的工作，通过巧妙的“螯合剂导向多价工程”策略，同时解决了传统FAPI探针标记条件苛刻、肿瘤滞留不足两大瓶颈。相比已报道的二聚体(如[68Ga]Ga-HBED-CC-FAPI-02)和四聚体，该三聚体在保留高亲和力的同时，实现了更优的肿瘤/背景比和延迟显像窗口。临床头对头比较显示其优于[68F]FDG和[68Ga]Ga-FAPI-04，尤其在肝癌、结直肠癌等FAP高表达肿瘤中具有独特价值。该研究为FAPI放射诊疗一体化提供了新思路，也为TRAP支架在其他靶点(如PSMA、SSTR)多聚体探针开发中开辟了新方向。