超高灵敏！NanoLuc斑马鱼平台赋能肾毒性与药物高通量筛选！

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A novel zebrafish luminescent biosensor for kidney tubulopathy, metal toxicity, and drug screening

中文标题：用于肾小管病变、金属毒性和药物筛选的新型斑马鱼生物发光传感器

发表期刊：《Disease Models & Mechanisms》

影响因子：3.3

作者单位：

1.Department of Physiology, University of Zurich, Zurich, Switzerland

2.Department of Nephrology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, China

3.Department F.-A.Forel for Environmental and Aquatic Sciences, School of Earth and Environmental Sciences, Faculty of Science, University of Geneva, Geneva, Switzerland

4.Department of Molecular Life Sciences, University of Zurich, Zurich, Switzerland

作者信息：

第一作者：Han Lai

通讯作者：Olivier Devuyst、Zhiyong Chen

研究背景

肾脏近端小管上皮细胞的内溶酶体途径是介导低分子量蛋白重吸收与代谢的核心通路，先天性遗传疾病、后天获得性损伤、药物暴露及重金属污染均会破坏该通路功能，引发小分子蛋白尿与肾小管病变，临床检测小分子蛋白尿是诊断近端小管损伤最敏感的指标;斑马鱼原肾与人类肾脏节段高度保守，是研究肾小管病变与肾毒性的理想模式生物，但传统检测方法依赖注射荧光示踪剂，存在操作繁琐、定量困难、灵敏度低等缺陷，前期研发的 vdbp-mCherry-ELISA 报告系统虽可检测小分子蛋白尿，但存在动态范围窄、成本高、耗时长的局限;NanoLuc 荧光素酶具有超高灵敏度、宽动态范围、操作简便的优势，因此本研究构建融合维生素 D 结合蛋白与 NanoLuc 的 ½vdbp-NanoLuc 转基因斑马鱼生物传感器，旨在验证其在遗传性内溶酶体疾病、药物肾毒性、重金属毒性检测中的可靠性，并探索其在肾保护药物高通量筛选中的应用价值。

研究方法

本研究采用多片段 Gateway 克隆与 Tol2 转座子技术，构建肝脏特异性启动子驱动 ½vdbp-NanoLuc、心脏启动子驱动 EGFP 的转基因载体，制备稳定遗传的 ½vdbp-NanoLuc 斑马鱼品系;分别构建 lrp2a 基因敲除(megalin 缺失，模拟 Donnai-Barrow 综合征)、ctns 基因敲除(胱氨酸转运体缺陷，模拟胱氨酸病)两种遗传性近端小管病变模型，庆大霉素和顺铂诱导药物肾毒性模型，镉、铜、铅三种环境金属暴露毒性模型;通过生物发光显微镜、透射电镜、多光子荧光显微镜观察斑马鱼幼鱼形态、近端小管亚细胞结构及溶酶体 / 自噬囊泡变化，采用发光法定量检测尿液中 vdbp-NanoLuc 荧光素酶活性，ELISA 法检测尿液 vdbp-mCherry 水平，qPCR 检测金属硫蛋白 mt2 的 mRNA 表达，ICP-MS 检测幼鱼体内金属富集量，自动化行为分析仪评估幼鱼游泳能力，计算批内与批间变异系数验证检测稳定性，同时对 30 种抗氧化化合物进行高通量筛选，评估其对顺铂肾毒性的保护作用，所有数据采用非参数 Mann-Whitney 检验进行统计学分析。

实验结果

图1：½vdbp-NanoLuc 斑马鱼报告系统的构建与验证

图1 系统完成了新型生物发光斑马鱼报告系统的构建与生理功能验证，研究将斑马鱼维生素 D 结合蛋白 N 端片段与 NanoLuc 荧光素酶融合，在肝脏特异性启动子 lfabp10a 驱动下表达，同时以心脏 EGFP 作为转基因筛选标记;体外实验证实 NanoLuc 可催化底物产生 460nm 蓝光，且光强度与蛋白浓度呈正相关，在体观察显示 5dpf 转基因幼鱼肝脏与血管可检测到清晰生物发光信号，心脏表达绿色荧光;蛋白检测证实 vdbp-NanoLuc 融合蛋白在肝脏、血液、肾脏中稳定表达，正常生理状态下该融合蛋白经肝脏分泌入血、肾小球滤过后被近端小管完全重吸收，尿液中无荧光素酶活性，彻底验证了该报告系统符合肾脏生理代谢规律，可作为检测近端小管重吸收功能的理想工具。

图2：遗传性近端小管病变模型中验证生物发光报告系统

图2 在两种经典遗传性内溶酶体疾病模型中证实了 ½vdbp-NanoLuc 系统的高灵敏性与可靠性，lrp2a 敲除幼鱼因 megalin 内吞受体缺失，近端小管顶端内吞囊泡显著减少，尿液中 vdbp-NanoLuc 信号较野生型升高 30 倍，较传统 vdbp-mCherry-ELISA 方法灵敏度提升 2 倍;ctns 敲除幼鱼因溶酶体胱氨酸蓄积出现近端小管刷状缘损伤、致密囊泡蓄积，尿液荧光信号升高 4 倍，而 mTORC1 抑制剂雷帕霉素可显著逆转该异常，证明该系统不仅能精准检测遗传性近端小管功能障碍，还可定量评估靶向药物的治疗效果，为遗传性肾病的机制研究与药物筛选提供可靠模型。

图3：生物发光报告系统高效检测药物诱导的肾毒性

图3 证实 ½vdbp-NanoLuc 系统可快速、灵敏检测临床药物引发的肾毒性，庆大霉素处理导致近端小管溶酶体磷脂沉积、致密囊泡蓄积，尿液 vdbp-NanoLuc 信号升高近 100 倍，牛磺酸共处理可显著缓解该损伤;顺铂暴露导致幼鱼鳔发育缺陷、游泳能力显著下降，尿液荧光信号升高 16 倍，而硫代硫酸钠(STS)共处理可完全逆转顺铂诱导的肾损伤与行为异常;该结果证明系统可精准识别药物肾毒性的剂量效应与时间效应，同时快速筛选具有肾保护作用的候选化合物，为临床药物肾毒性评估提供新型体外筛选平台。

图4：vdbp-NanoLuc 传感器特异性检测金属诱导的肾毒性差异

图4 利用该传感器首次区分了不同重金属对肾脏近端小管的毒性差异，环境相关浓度的镉、铜暴露(≥20μg/L)即可诱导幼鱼出现小分子蛋白尿与鳔发育异常，铅暴露则无明显小分子蛋白尿仅影响游泳行为;机制研究显示镉、铜可诱导近端小管溶酶体大量蓄积、自噬功能障碍，同时金属硫蛋白 mt2 的 mRNA 表达分别上调 12 倍与 5 倍，铅无上述效应;对比实验证实 NanoLuc 发光检测法在 20μg/L 低浓度铜暴露下即可检出阳性信号，而传统 mCherry-ELISA 法无法识别，充分证明该传感器在金属肾毒性早期检测中具备超高灵敏度，可用于环境重金属污染的快速筛查。

图5：½vdbp-NanoLuc 系统用于肾保护药物高通量筛选

图5 建立了 “尿液生物发光信号 + 游泳行为” 双指标的高通量药物筛选体系，对 30 种抗氧化化合物进行筛选后发现，硫代硫酸钠(STS)可完全逆转顺铂诱导的小分子蛋白尿与游泳能力下降，牛磺酸可部分缓解肾损伤，而氢化可的松则显著加重肾小管损伤;该筛选体系仅需单条幼鱼、单孔检测，操作步骤简化至 3 步，96 孔板检测全程仅需 20 分钟，成本较传统 ELISA 降低 20 倍，证明该系统可实现低成本、高通量、自动化的肾保护化合物筛选，大幅提升药物研发效率。

研究结论

本研究成功构建了基于 vdbp-NanoLuc 融合蛋白的新型转基因斑马鱼生物发光传感器，该系统以肝脏分泌的低分子量配体 VDBP 为报告分子、NanoLuc 为信号元件，可无创、快速、超高灵敏地检测肾脏近端小管功能障碍引发的小分子蛋白尿;该传感器在遗传性内溶酶体肾病、庆大霉素 / 顺铂药物肾毒性、镉 / 铜重金属肾毒性检测中均表现出优异的特异性与灵敏度，检测效能远超传统 ELISA 方法，同时可联合行为学分析实现肾保护化合物的高通量自动化筛选;该新型传感器为肾小管病变的机制研究、环境肾毒性物质筛查、临床肾保护药物研发提供了低成本、高效率、高灵敏度的全新模式生物平台，具有重要的基础研究与转化应用价值。