体外构建高血管化原代肝细胞球体的促血管生成策略

研究背景

原代肝细胞是模拟体内肝细胞表型的理想材料，但传统体外培养(包括 2D 培养和无血管 3D 球体培养)存在营养和氧气传递不足的问题，导致肝细胞功能快速衰退，难以构建大规模功能性肝组织。血管化是解决这一困境的关键，而如何在体外实现原代肝细胞球体的高效血管化，尤其是让微血管穿透球体内部，一直是生物制造领域的难题。因此，开发一种可靠的促血管生成策略，构建高血管化肝细胞球体，对肝组织工程、药物筛选及肝移植替代研究具有重要意义。

来自日本庆应义塾大学的团队在《Biofabrication》上发表题为Construction of highly vascularized hepatic spheroids of primary hepatocytes via proangiogenic strategy in vitro的研究，通过在原代肝细胞球体中引入成纤维细胞作为旁分泌因子来源，结合微流控装置与纤维蛋白 - 胶原蛋白水凝胶，成功诱导内皮细胞形成穿透性微血管网络，构建出模拟肝血窦结构的高血管化肝细胞球体，显著提升白蛋白分泌和尿素合成功能。

实验方法

细胞准备：采用两步胶原酶灌注法分离 SD 大鼠原代肝细胞(rHep)，经 Percoll 梯度离心纯化(存活率>90%);人肺成纤维细胞(hLF)和红色荧光蛋白(RFP)标记的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别在专用培养基中培养至第 6 代备用。

肝细胞 - 成纤维细胞球体形成：将 rHep 与 hLF 按不同比例(1:3、2:2、3:1)混合，调整细胞总数为 10000 或 20000 个 / 球体，接种到海藻酸盐非粘附凹孔中，培养 2 天自发形成多细胞球体。

微流控装置准备与球体嵌入：通过软光刻技术制备含 3 条平行微通道的 PDMS 微流控装置(中央通道用于装载球体和水凝胶，两侧通道用于接种 HUVEC);将形成的球体悬浮于纤维蛋白 - 胶原蛋白水凝胶预聚体中，注入中央通道，加入凝血酶引发凝胶化。

共培养与血管化诱导：向微流控装置两侧通道接种 RFP-HUVEC，使用肝细胞培养基与内皮细胞培养基的 1:1 混合液培养，每日更换一半培养基，持续培养 14 天，观察微血管形成过程;部分实验使用改良装置(中央通道宽度从 2600μm 缩短至 1800μm)增强旁分泌因子浓度梯度。

功能与结构鉴定：通过酶联免疫吸附试验检测白蛋白分泌，比色法检测尿素合成;免疫荧光染色(CD31 标记内皮细胞、MRP2 标记胆小管)观察结构;活细胞成像追踪血管化动态;ImageJ 软件定量微血管长度和直径。

关键结果

图 1 非粘附凹孔中肝细胞 - 成纤维细胞球体的形成

该图展示了球体形成的流程与特性：(A)海藻酸盐非粘附凹孔的制备及球体形成示意图;(B)凹孔在 24 孔板中的实物图;(C)不同 hLF:rHep 比例形成的球体相差显微镜图像;(D)球体直径定量分析。结果显示，2 天内可成功形成结构完整的球体，细胞总数 20000 个的球体直径约 500μm(超过 300μm 扩散极限)，且球体直径随成纤维细胞比例增加而减小，为后续血管化需求提供了足够大的球体模型。

图 2 微流控装置中球体与 HUVEC 共培养后的血管芽形成

该图呈现了共培养早期的血管诱导效果：(A)微流控装置结构及共培养示意图(球体位于中央水凝胶通道，HUVEC 接种于两侧通道);(B)第 3 天血管芽形成的相差显微镜图像(箭头指示朝向球体延伸的血管芽);(C)血管芽数量定量分析。结果表明，细胞总数 20000 个、hLF:rHep=3:1 的球体诱导的血管芽数量最多，是 1:3 比例的 2 倍以上，证实成纤维细胞的旁分泌作用可显著促进血管芽形成。

图 3 不同 hLF:rHep 比例对血管生成的影响

该图通过活细胞成像展示了第 14 天的血管化差异：(A)GFP 标记 rHep(绿色)与 RFP-HUVEC(红色)的投影图像及球体横截面(箭头指示穿透球体的微血管);(B)微血管总长度定量;(C)微血管分支数定量。结果显示，hLF:rHep=2:2 和 3:1 的球体实现高度血管化，微血管穿透球体内部并围绕肝细胞分布，而 1:3 比例的球体几乎无血管化，且肝细胞荧光强度显著降低，证明成纤维细胞比例是血管化成功的关键。

图 4 肝细胞球体的血管化动态过程(hLF:rHep=3:1)

该图追踪了 14 天内的血管化进程与肝细胞维持情况：(A)不同时间点的活细胞投影图像，可见 HUVEC 从第 3 天开始形成血管芽，第 7 天到达球体表面，第 14 天完全穿透并形成网络，高倍镜下可见肝细胞间的胆小管样结构(箭头);(B)肝细胞组织面积定量分析。结果显示，血管化过程中肝细胞面积虽在第 1-5 天略有下降，但第 7 天后逐渐恢复，至第 14 天仍保持稳定，证实血管化可有效维持肝细胞存活。

图 5 单培养条件下肝细胞球体的衰退过程

该图为无 HUVEC 共培养的对照实验：(A)不同时间点 GFP-rHep 的投影图像;(B)肝细胞组织面积定量。结果显示，单培养球体的肝细胞面积从第 1 天起持续显著下降，至第 14 天几乎完全衰退，与共培养组形成鲜明对比，直接证明血管化对肝细胞长期存活的必要性。

图 6 血管化球体的类肝血窦结构分析

该图揭示了血管化球体的微观结构：(A)CD31 标记(红色)与 GFP-rHep(绿色)的免疫荧光图像;(B)微血管管腔直径分布(平均 12.6±8.4μm，主要集中在 5-10μm);(C)球体横截面图像(箭头指示肝细胞与微血管紧密接触的类血窦结构);(D)体内肝血窦结构示意图。结果证实，血管化球体中的微血管具有功能性管腔，且与肝细胞形成紧密接触，高度模拟体内肝血窦的空间关系。

图 7 血管化球体的肝功能评估

该图量化了白蛋白分泌和尿素合成功能：(A)不同时间点白蛋白分泌量，共培养组第 14 天水平较第 1 天提升 1.6 倍，而单培养组持续下降;(B)不同时间点尿素合成量，共培养组第 14 天达到第 1 天的 6.8 倍，单培养组则逐渐降低。结果表明，血管化显著增强了肝细胞的核心代谢功能，且尿素合成的提升更为显著，可能与内皮细胞释放氨供肝细胞代谢有关。

图 8 血管化球体中肝细胞的极性鉴定

该图验证了肝细胞的极性与结构完整性：(A)MRP2 标记(粉色，胆小管)、CD31(红色)、细胞核(蓝色)与 GFP-rHep(绿色)的免疫荧光图像(箭头指示胆小管样结构);(B)CellTracker Red CMTPX 染料代谢实验(粉色指示排泄到胆小管的染料)。结果显示，血管化球体中的肝细胞恢复极性，形成功能性胆小管，具备物质排泄能力，进一步证实肝细胞功能的完整性。

图 9 改良微流控装置加速血管化

该图展示了缩短中央通道宽度后的优化效果：(A)改良装置(1800μm)与原装置(2600μm)结构示意图;(B)VEGF 扩散模拟(红色为高浓度，蓝色为低浓度);(C)VEGF 浓度及梯度定量分析;(D)改良装置第 9 天的免疫荧光图像。结果显示，改良装置增强了 VEGF 浓度梯度，使血管化时间从 14 天缩短至 9 天，且 hLF:rHep=2:2 的球体也能实现高效血管化，为优化血管化效率提供了新策略。

全文总结

本文发表于《Biofabrication》2025 年第 17 卷，针对传统原代肝细胞培养的营养传递难题，提出了 “成纤维细胞 + 微流控 + 水凝胶” 的三位一体促血管生成策略：通过成纤维细胞分泌 VEGF、FGF 等旁分泌因子，结合微流控装置精准调控细胞微环境，成功构建出具有类肝血窦结构的高血管化肝细胞球体。该球体不仅实现了微血管对球体的穿透性浸润，还显著提升了肝细胞的白蛋白分泌、尿素合成功能及极性维持，解决了大规模功能性肝组织构建的核心瓶颈。研究同时证实，成纤维细胞比例和旁分泌因子浓度梯度是血管化成功的关键，改良微流控装置可进一步加速血管化进程。但该模型仍存在局限性，如使用大鼠原代肝细胞而非人类肝细胞，成纤维细胞过度增殖可能引发炎症或纤维化，未来需通过细胞封装等技术优化。总体而言，该方案为肝组织工程、药物代谢研究及肝移植替代材料开发提供了高效可行的体外模型，具有重要的转化应用价值。