成年小鼠耳郭原代成纤维细胞分离与培养标准化方案

研究背景

原代成纤维细胞是体外研究机体生物学特性的理想模型，在伤口愈合、细胞周期、重编程和衰老研究中应用广泛。现有分离方案多依赖皮肤、尾巴等组织，而耳郭组织作为实验后常被丢弃的资源，尚未被充分利用。本研究提供的方案操作简便、成本适中，无需专用试剂盒，可稳定获得高产量、高纯度的原代成纤维细胞，填补了原代细胞分离中资源高效利用的需求缺口。

由美国南加州大学的团队发表在《STAR Protocols》上题为Protocol for isolation of adult mouse ear pinnae-derived primary fibroblasts的文章，建立了从成年小鼠耳郭(常被丢弃的组织资源)分离原代成纤维细胞的标准化流程，该方案适用于不同性别、年龄(3-29 个月)和基因型的小鼠，分离的细胞纯度高达 90% 以上(CD140a/PDGFRα 或 CD90.2/THY1.2 阳性)，可用于细胞周期调控、重编程、衰老及炎症相关研究，实现了实验资源的最大化利用。

实验方法

1.组织收集：安乐死小鼠后，70% 乙醇消毒耳郭区域，剃除毛发，剪下双侧耳郭放入含抗生素的组织洗涤缓冲液中，冰上保存(可 4℃存放 3 天)。

2.乙醇清洗与组织切割：耳郭经两次 70% 乙醇洗涤(每次 5 分钟)和组织洗涤缓冲液冲洗后，切割为 1-3mm³ 的碎片，接种至 10cm 培养皿，加入初始生长培养基(含 Normocin 防污染)，37℃、5% CO₂培养。

3.初始培养与换液：接种后 3 天首次换液，7 天再次换液，培养 10-14 天至细胞簇融合，期间避免扰动组织碎片影响细胞迁移附着。

4.传代扩增：P0 代细胞用 0.25% 胰酶消化，经 70μm 滤网去除组织碎片，接种为 P1 代;P1 代细胞长满后 1:4 传代至 P2 代，P2 代长满后分至 4 个培养皿扩增为 P3 代。

5.细胞冻存与复苏：P3 代细胞用含 10% DMSO 的冻存液冻存(-80℃过渡后移至液氮);复苏时 37℃快速解冻，用含 10% FBS 的长期培养基洗涤去除 DMSO，接种后 24 小时即可用于实验。

6.纯度验证(可选)：采用流式细胞术，以 CD45(泛免疫细胞标志物)排除免疫细胞污染，检测 CD140a(PDGFRα)和 CD90.2(THY1.2)成纤维细胞特异性标志物，验证细胞纯度。

关键结果

图 1：原代成纤维细胞培养流程时间线

该图展示了整个实验的关键时间节点：组织收集后 3 天首次换液，7 天二次换液，10-14 天进行 P0→P1 传代，约 17 天进行 P1→P2 传代，20 天进行 P2→P3 传代，23 天冻存 P3 代细胞;复苏后可通过长期培养基维持培养，P3 代后建议 10 代内使用以避免衰老或转化。

图 2：耳郭组织处理步骤可视化

A 图显示耳郭剃毛后转移至 6 孔板准备洗涤;B 图展示 “两次乙醇洗涤 + 一次缓冲液洗涤” 的消毒流程， excess 乙醇用纸巾吸除避免细胞毒性;C 图为切割后的组织碎片接种至培养皿;D 图显示接种初期显微镜下无可见细胞，仅能观察到组织碎片，验证了初始接种的无菌状态。

图 3：原代成纤维细胞迁移与生长过程

培养 3 天后(P0 Day3)，少量成纤维细胞从组织碎片迁移而出(A、B 图，5× 和 10× 放大);7 天后(P0 Day7)细胞簇明显增多且形态典型(长梭形，C、D 图);10 天后(P0 Day10)细胞簇融合成片，达到传代标准(E、F 图)，证实该方案下细胞迁移生长稳定。

图 4：P0 代培养中共存的 “肌样细胞”

P0 代培养中会伴随少量 “肌样细胞”(箭头所示)，这类细胞呈宽大的肌细胞样形态(A、B 图，5× 和 10× 放大);由于其增殖效率低于成纤维细胞，经 P0-P3 三次传代后会逐渐耗尽，最终获得纯化的成纤维细胞群体。

图 5：P1 代成纤维细胞形态与增殖

P1 代接种 1 天后，细胞呈分散的长梭形，无组织碎片残留(A、B 图);5 天后细胞快速增殖，达到 80%-90% 汇合度(C、D 图)，证实传代后细胞保持良好的增殖活性，且滤网过滤有效去除了组织杂质。

图 6：流式细胞术纯度验证结果

A 图为成纤维细胞分选策略：先排除碎片和双细胞，再筛选 CD45⁻细胞，最终鉴定 CD140a⁺或 CD90.2⁺细胞为成纤维细胞;B 图以腹腔灌洗液为对照，验证 CD45⁺免疫细胞分选的特异性;C 图显示 3 只 4 月龄雌雄小鼠的细胞纯度均 > 90%(CD45⁻CD140a⁺或 CD45⁻CD90.2⁺);D 图证实对照样本中 CD45⁺细胞占比高，成纤维细胞标志物阳性率低，进一步验证了分离细胞的高纯度。

全文总结

本研究建立了一套标准化的成年小鼠耳郭原代成纤维细胞分离培养方案，核心优势在于：利用常被丢弃的耳郭组织作为细胞来源，实现实验资源最大化;适用于不同性别、年龄(3-29 个月)和基因型的小鼠，适用性广;分离的细胞产量高(每只小鼠可获得 4 个 10cm 培养皿的 P3 代细胞，每皿 1.5-2.5×10⁶个细胞)、纯度高(>90% 成纤维细胞特异性标志物阳性，CD45⁺免疫细胞污染 < 0.5%);操作简便，无需专用试剂盒，成本适中。