小鼠肝脏原代枯否细胞（KC）的分离纯化改良方法

研究背景

枯否细胞(KC)作为肝脏主要驻留巨噬细胞，占肝非实质细胞 30%，在肝炎症、缺血再灌注损伤及肿瘤免疫中发挥关键作用，体外原代培养是其机制研究的核心手段。传统 KC 分离依赖 Ⅳ 型胶原酶原位灌注结合 Percoll 密度梯度离心，但该方法存在明显缺陷：耗时久、胶原酶用量大、细胞损失多，单只小鼠产量仅约 2×10⁶个，难以满足后续实验需求。

重庆医科大学附属第一医院的团队在《细胞与分子免疫学杂志》上发表改良方案：通过 “分次低速离心 + 差速贴壁” 替代 Percoll 密度梯度离心，简化操作流程，显著提升 KC 产量(达 5.83±0.54×10⁶个 / 只)与活力(92%)，且纯度保持 90% 以上，为 KC 相关体外研究提供高效、经济的技术支撑。

实验方法

1. 肝脏原位灌注与消化

小鼠 10% 水合氯醛(0.3mL / 只)腹腔麻醉，门静脉穿刺插管，先以 37℃ D-Hanks 液灌注洗去血液(肝脏由暗红变土黄)，再换用 0.5g/L Ⅳ 型胶原酶灌注液(现配现用)，夹闭下腔静脉循环灌注 5min(3-5 个循环)，至肝脏柔软塌陷;

无菌取出肝脏，剔除胆囊，预冷培养皿中轻柔撕碎，加入 5mL 胶原酶液，37℃摇床消化 15min，200 目筛网过滤获得单细胞悬液。

2. 改良法分离纯化 KC(分次低速离心 + 差速贴壁)

细胞悬液 500×g 离心 3min×3 次，去除上清与杂质;沉淀用 RPMI1640 重悬，50×g 离心 3min×3 次，收集上清(含 KC 等非实质细胞)，弃沉淀(肝细胞为主);

上清 500×g 离心 3min，沉淀用 PBS 洗涤 3 次，2mL 完全培养基(RPMI1640+10% FBS+1% 双抗)重悬，接种至 6cm 培养皿，37℃孵箱培养 2h，PBS 冲洗去除未贴壁细胞，剩余贴壁细胞即为 KC。

3. 传统 Percoll 密度梯度离心法(对照)

细胞悬液经 500×g 离心纯化后，重悬于 3mL RPMI1640，依次叠加 3mL 70% Percoll(1.097g/mL)与 300% Percoll(1.045g/mL)，1500×g、4℃离心 20min，吸取中间细胞层，PBS 洗涤 3 次获得 KC。

4. KC 鉴定与功能验证

纯度与活力鉴定：台盼蓝染色检测活力，流式细胞术(F4/80-PE 抗体)检测纯度，免疫荧光染色观察 F4/80 表达;

功能验证：吞墨实验观察吞噬能力;构建缺氧 / 复氧模型(缺氧 3h，复氧 2-6h)，ELISA 检测 TNF-α 分泌，流式细胞术检测 MHCⅡ、CD40、CD86 表面分子表达。

关键结果

图1：流式细胞术鉴定 KC 纯度

A 图为空白对照组(无抗体标记)，B 图为 F4/80-PE 抗体染色组，结果显示 F4/80 阳性细胞占比达 90.5%，证实改良法分离的 KC 纯度达 90% 以上。

图2：培养 72h 的 KC 形态

相差显微镜下(×400)，KC 呈典型星形或棘状，体积较大，边界清晰，胞质丰富，胞核呈椭圆形，符合成熟 KC 的形态特征。

图3：KC 的 F4/80 免疫荧光鉴定

A 图为培养 24h KC，B 图为培养 72h KC;F4/80 阳性细胞呈绿色荧光，DAPI 染核为蓝色，证实贴壁细胞主要为 KC，且随培养时间延长形态更典型。

图4：KC 墨汁吞噬实验

A 图为正常 KC，B 图为吞噬墨汁后的 KC(箭头示胞内黑色碳颗粒);相差显微镜下可见胞质内大量碳颗粒，证实分离的 KC 具有正常吞噬功能。

图5：缺氧 / 复氧模型中 KC 分泌 TNF-α 水平

柱状图显示，随复氧时间延长(2-6h)，KC 分泌 TNF-α 量逐渐升高，复氧 6h 时达峰值，且显著高于 0h 组(P<0.05)，提示 KC 在缺氧复氧条件下被炎症激活。

图6：缺氧 / 复氧后 KC 表面分子表达变化

A 图为流式检测代表性图像，B 图为半定量分析;与对照组相比，缺氧 / 复氧组 KC 表面 MHCⅡ、CD40、CD86 分子表达显著升高(P<0.05)，证实 KC 处于炎症激活状态。

全文总结

重庆医科大学团队建立了 BALB/c 小鼠 KC 分离纯化的改良方法，通过 “Ⅳ 型胶原酶原位循环灌注 + 分次低速离心 + 差速贴壁” 替代传统 Percoll 密度梯度离心，单只小鼠 KC 产量达(5.83±0.54)×10⁶个(显著高于传统法的 2.19±0.43×10⁶个)，活力 92%、纯度 90% 以上，且操作简便、耗时短、成本低;功能验证显示，分离的 KC 具有正常吞噬能力，缺氧复氧条件下可激活并分泌 TNF-α、上调 MHCⅡ/CD40/CD86 分子表达。该方法解决了传统技术产量低、操作复杂的痛点，为 KC 相关肝疾病机制研究提供稳定可靠的细胞模型，局限性在于小鼠年龄异质性可能影响细胞贴壁效率，需进一步优化流程。