点亮胰腺神经内分泌肿瘤：利用新型生物发光细胞系构建小鼠模型！

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：Lighting up PNETs: Creating Murine Models with a Novel Bioluminescent Cell Line

中文标题：点亮胰腺神经内分泌肿瘤：利用新型生物发光细胞系构建小鼠模型

发表期刊：《Annals of Surgical Oncology》

影响因子：3.5

作者单位：

1.Department of Surgery, Cooper University Health Care, Camden, NJ, USA

2.Department of Pathology, Cooper University Health Care, Camden, NJ, USA

3.Department of Surgery, Rowan University School of Medicine, Camden, NJ, USA

4.Camden Cancer Research Center, Camden, NJ, USA

5.MD Anderson Cancer Center at Cooper, Camden, NJ, USA

作者信息：

第一作者：Matthew C. Moccia、Rachel Nation(共同第一作者)

通讯作者：Tao Gao、Young Ki Hong

研究背景

胰腺神经内分泌肿瘤(PNETs)是发病率极低的罕见恶性肿瘤，晚期患者除手术外缺乏有效治疗手段，其核心特征为高度生物学异质性，肿瘤进展受复杂信号通路异常调控;当前临床前肿瘤模型存在诸多局限，细胞源性异种移植模型操作简便但难以模拟人 PNET 真实生物学特征，可用 PNET 细胞系数量有限且小鼠源性细胞系稀缺，皮下移植模型易监测但无法还原肿瘤微环境，胰腺原位等模型难以无创实时示踪，同时缺乏可精准监测肿瘤进展、示踪单个肿瘤细胞的高效模型，因此本研究旨在构建稳定共表达萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白的 STC-1 小鼠细胞系，通过三种不同移植方式构建 PNET 小鼠模型，筛选最贴近人高分化 1 级 PNET 的临床前模型，为 PNET 生物学机制研究与新型疗法评估提供可靠工具。

研究方法

本研究采用慢病毒转染技术，将携带萤火虫荧光素酶 - 2A 连接肽 - EGFP 融合基因的载体导入小鼠肠内分泌肿瘤 STC-1 细胞，经嘌呤霉素筛选与流式细胞分选获得稳定双标记细胞系;将 1×10⁶个双标记 STC-1 细胞与 Matrigel 基质胶混合，分别以皮下注射、肾包膜下注射、胰腺原位注射三种方式植入免疫缺陷 Nu/J 小鼠体内，每组 4 只，另设胰腺注射 Matrigel+PBS 的空白对照组;实验期间每周通过活体生物发光成像系统监测肿瘤生长与转移情况，同步记录小鼠体重、一般状态，连续观察 6 周;处死后获取肿瘤及远处器官组织，经固定、石蜡包埋、切片后，通过 H&E 染色观察组织形态，免疫组化检测 Ki-67、突触素、嗜铬粒素 A、胰岛素、分泌素、胰多肽及 EGFP 的表达，免疫荧光共定位进行肿瘤细胞谱系示踪，以人 1 级、2 级 PNET 组织为对照，使用 ImageJ 定量分析标志物表达密度，采用单因素方差分析进行统计学检验。

实验结果

图1：双标记 STC-1 细胞系的构建与体内成像验证

图1 完成了 F-Luc/EGFP 双标记 STC-1 细胞系的构建与有效性验证，流式细胞术结果显示，转染后细胞存活率超 95%，EGFP 阳性细胞比例从对照组 6.54% 提升至 46.39%，荧光显微镜下可见转染细胞呈现稳定绿色荧光，且连续培养 6 个月未出现荧光丢失、形态异常或增殖改变，证实双标记基因稳定整合且不影响细胞生物学特性;该结果为后续体内移植、生物发光成像与体外谱系示踪奠定了稳定的细胞基础，确保了后续模型构建的可靠性与示踪的精准性。

图2：三种移植模型的肿瘤生长与小鼠体重动态

图2 系统对比了皮下、肾包膜、胰腺原位三种移植模型的肿瘤生长与小鼠生理状态，6 周观察期内，三组模型小鼠均出现体重下降，其中胰腺原位模型体重下降最显著，肾包膜模型次之，皮下模型最轻，提示胰腺原位肿瘤负荷对小鼠生理状态影响最大;活体生物发光成像显示三组均形成可见肿瘤，胰腺原位组出现 1 例转移灶，且生物发光信号强度显著高于皮下组;离体肿瘤测量显示，皮下与肾包膜模型肿瘤平均直径分别为 5.78mm、6.23mm，胰腺原位模型达 11.33mm，生长速度显著更快，该结果直接证实胰腺原位移植更能促进肿瘤侵袭性生长，且生物发光成像可作为无创监测肿瘤进展的可靠手段。

图3：三种移植模型的组织学与免疫组化特征分析

图3 通过组织学与免疫组化全面评估三种模型对人 PNET 的模拟能力，H&E 染色显示肾包膜与胰腺原位模型呈现人 1 级 PNET 典型形态特征，皮下模型缺乏核心 PNET 组织学特征;Ki-67 染色显示胰腺原位模型增殖活性显著高于皮下模型，符合人 1 级 PNET 增殖特征;神经内分泌标志物检测显示，胰腺原位模型突触素、嗜铬粒素 A、胰岛素、分泌素、胰多肽表达均显著高于皮下与肾包膜模型，且与人类 1 级、2 级 PNET 表达谱高度一致，EGFP 染色证实胰腺原位肿瘤中移植细胞定植效率最高，该结果明确胰腺原位模型在组织形态、神经内分泌分化上最贴近人高分化 PNET。

图4：三种模型免疫组化标志物密度定量对比

图4 对三种模型的关键标志物表达进行定量统计分析，结果显示胰腺原位模型的 Ki-67、突触素、嗜铬粒素 A、胰岛素、分泌素、胰多肽及 EGFP 阳性细胞密度均显著高于皮下与肾包膜模型，皮下模型各项标志物表达最低，肾包膜模型介于两者之间;其中突触素、嗜铬粒素 A 作为 PNET 核心诊断标志物，在胰腺原位模型中的表达量较皮下模型分别提升 27.2、40.46，差异极显著，该定量结果进一步证实胰腺原位模型在神经内分泌分化、肿瘤增殖、细胞定植上均优于另外两种模型，是模拟人 PNET 的最优选择。

图5：PNET 模型中神经内分泌标志物的免疫荧光共定位分析

图5 通过免疫荧光共定位验证移植细胞的神经内分泌分化特征，EGFP 标记的 STC-1 细胞在胰腺原位模型中与突触素、嗜铬粒素 A、分泌素、胰多肽呈现高度共定位，而皮下模型共定位比例极低，肾包膜模型共定位水平介于两者之间;胰岛素与 EGFP 共定位比例不足 10%，提示胰岛素表达并非 STC-1 源性肿瘤的核心功能表型，该结果直观证实胰腺微环境可有效维持移植细胞的神经内分泌表型，而皮下微环境无法支持肿瘤细胞的特异性分化，进一步验证了胰腺原位模型的生物学优势。

图6：EGFP 标记 STC-1 细胞的谱系示踪定量分析

图6 对三种模型中移植细胞的谱系示踪结果进行定量统计，胰腺原位模型中 EGFP 阳性细胞共表达突触素、嗜铬粒素 A、分泌素、胰多肽的比例均显著高于皮下与肾包膜模型，肾包膜模型中 EGFP 细胞共表达嗜铬粒素 A、胰岛素的比例显著高于皮下模型;该结果明确胰腺微环境是驱动 STC-1 细胞向 PNET 表型分化的核心条件，皮下环境缺乏维持神经内分泌分化的关键信号，肾包膜微环境仅能部分支持分化，最终证实胰腺原位移植可最大程度还原 PNET 的克隆构成与分化特征，具备最优的临床模拟价值。

研究结论

本研究成功构建稳定共表达萤火虫荧光素酶与 EGFP 的双标记 STC-1 细胞系，通过皮下、肾包膜、胰腺原位三种方式构建 PNET 小鼠模型，系统对比发现胰腺原位模型肿瘤生长更活跃、组织形态与神经内分泌标志物表达最贴近人高分化 1 级 PNET，同时可通过活体生物发光无创实时监测肿瘤进展，借助 EGFP 实现精准谱系示踪;皮下模型操作简便但缺乏 PNET 核心特征，肾包膜模型生长适中但分化表型不足，胰腺原位模型凭借对胰腺微环境的还原，成为兼具生物学相关性与实用性的 PNET 临床前平台，可用于 PNET 发病机制研究与新型治疗药物的临床前评估，弥补了现有 PNET 模型的关键短板。