人视网膜类器官模型揭示 MYCN 扩增视网膜母细胞瘤的发育易感窗口与治疗脆弱性

视网膜母细胞瘤(RB)是儿童罕见眼癌，多数由 RB1 基因双等位失活驱动，但约 1.5% 的病例为 MYCN 基因扩增且无 RB1 突变，这类亚型具有发病早、进展快、转移风险高的特点，临床预后差。现有模型(如细胞系、小鼠模型)难以复现人类视网膜发育动态及肿瘤起源，而人多能干细胞衍生的视网膜类器官可模拟体内视网膜层状结构与发育时序，为研究 MYCN 驱动的 RB 提供理想平台。本研究旨在通过视网膜类器官模型，明确 MYCN 介导肿瘤发生的发育易感窗口、分子机制及治疗脆弱性，填补该亚型研究的模型空白。

来自韩国延世大学医学院眼科、生物医学系统信息学系的团队在《International Journal of Molecular Sciences》上发表题为Human Retinal Organoid Modeling Defines Developmental Window and Therapeutic Vulnerabilities in MYCN-Amplified Retinoblastoma的研究。核心内容如下：

(1)实验设计与方法

视网膜类器官分化与 MYCN 转导：从人胚胎干细胞(hESC-H9)诱导视网膜类器官，在 3 个发育窗口(40-70 天、70-120 天、120-150 天)通过慢病毒转导 MYCN-GFP(对照为 GFP 单独)，伦理审批号为延世大学 IACUC 2017-0239;类器官经 1% PFA 固定、冷冻切片后，免疫荧光检测 SOX2(祖细胞 marker)、Ki-67(增殖 marker)、CRX(感光细胞 marker)。

类器官来源细胞系建立与异种移植： dissection MYCN 过表达类器官的 GFP 阳性肿瘤区域，悬浮培养建立 MYCN⁺细胞系;将 2×10⁴个 MYCN⁺细胞亚视网膜注射至 NOD-SCID 小鼠，2-9 个月后取眼做 HE 染色与免疫组化。

转录组分析：提取 MYCN 过表达类器官(MYCNᵒ/ᴱ-RBOs)、MYCN⁺细胞系、正常类器官(nROs)及 RB1 缺陷细胞系 Y79 的 RNA，进行 RNA-seq;通过 PCA、差异表达分析(|log₂FC|>1，adj p<0.05)、GSEA 富集通路(MYC 靶基因、mTORC1 信号)。

药物敏感性筛选：用 WST-1 法检测 MYCN⁺细胞与 Y79 细胞对 3 类药物的敏感性 —— 转录抑制剂(THZ1、Flavopiridol)、翻译抑制剂(Dactolisib)、MYC 稳定性调节剂(Volasertib)，计算 IC₅₀。

(2)关键结果

MYCN 致瘤的发育窗口：70-120 天转导组肿瘤发生率最高(80%，24/30)，显著高于早期(25%，5/20)与晚期(43.5%，10/23)，肿瘤细胞呈 SOX2⁺、Ki-67⁺、CRX⁻，为未分化视网膜祖细胞表型。

体内致瘤性验证：MYCN⁺细胞异种移植 2 个月后小鼠出现白瞳症，9 个月形成致密未分化肿瘤(无经典玫瑰花结结构)，免疫组化显示 Ki-67⁺、SOX2⁺、CRX⁻，与临床 MYCN 扩增 RB 一致。

分子通路特征：MYCNᵒ/ᴱ-RBOs 与患者 MYCN 扩增 RB 转录组高度相似，显著富集 MYC/E2F 靶基因、mTORC1 信号通路，下调感光细胞分化基因(ARR3、CNGB3)。

治疗脆弱性：MYCN⁺细胞对 THZ1(IC₅₀=21 nM)、Flavopiridol(IC₅₀=50.46 nM)、Volasertib(IC₅₀=273.7 nM)敏感，而 Y79 细胞耐药(THZ1 IC₅₀=2384 nM，Flavopiridol 无 IC₅₀)。

关键结果

图 1：MYCN 过表达类器官的致瘤性与细胞特征

该图明确 MYCN 致瘤的发育窗口与肿瘤细胞表型：(A)实验 timeline 显示 3 个转导窗口;(B)正常类器官在 6-30 周表达 SOX2(祖细胞)、Rhodopsin(成熟感光细胞)等 marker，验证分化正常;(C-D)MYCN-GFP 类器官 1 周时 GFP⁺细胞多，2 周后多数凋亡，仅少数增殖形成肿瘤(虚线框)，对照 GFP 类器官形态正常;(E-F)肿瘤区域 Ki-67⁺(增殖)、SOX2⁺(祖细胞)，CRX⁻(无感光分化)，Pearson 相关系数显示 MYCN-GFP 与 Ki-67(PCC=0.59)、SOX2(PCC=0.64)显著共定位，证实肿瘤来源于未分化祖细胞。

图 2：MYCN⁺细胞系的建立与体内致瘤性

该图验证类器官来源细胞的临床相关性：(A)MYCN⁺细胞悬浮培养形成肿瘤球，形态类似 Y79 细胞;(B)亚视网膜注射示意图;(C)移植 2 个月后小鼠眼出现白瞳症，对照眼正常;(D-E)HE 染色显示 2 个月肿瘤破坏视网膜结构，9 个月肿瘤细胞致密、核质比高，无玫瑰花结(MYCN 扩增 RB 特征);(F)9 个月肿瘤 Ki-67⁺、SOX2⁺、CRX⁻，与类器官肿瘤表型一致。

图 3：MYCN⁺类器官的转录组特征

该图揭示 MYCN 驱动的分子通路：(A)PCA 显示 MYCNᵒ/ᴱ-RBOs 与 MYCN⁺细胞聚为一簇，与 nROs、Y79 分离;(B)火山图显示 1533 个基因上调(细胞周期基因如 MKI67、CCNB1)、892 个基因下调(感光基因如 ARR3);(C)GO 分析显示下调 “光传导”、上调 “有丝分裂周期”;(D-E)GSEA 显示 MYCNᵒ/ᴱ-RBOs 与患者 MYCN 扩增 RB 均富集 MYC 靶基因、mTORC1 信号;(F)示意图总结：MYCN 激活 MYC/E2F 通路与 mTORC1 信号，抑制感光分化，维持祖细胞增殖。

图 4：MYCN⁺细胞的药物敏感性

该图筛选特异性治疗药物：(A)转录抑制剂中，THZ1 对 MYCN⁺细胞 IC₅₀=21 nM，Y79 为 2384 nM;Flavopiridol 对 MYCN⁺细胞 IC₅₀=50.46 nM，Y79 无 IC₅₀;(B)翻译抑制剂 Dactolisib 对 MYCN⁺细胞 IC₅₀=370.8 nM，Y79 耐药;(C)MYC 稳定性调节剂 Volasertib 对 MYCN⁺细胞 IC₅₀=273.7 nM，Y79 为 2420 nM，证实 MYCN⁺细胞对转录抑制与 PLK1 抑制敏感。

全文总结

本研究建立人视网膜类器官模型，首次确定 MYCN 扩增 RB 的发育易感窗口为 70-120 天，肿瘤起源于 SOX2⁺未分化视网膜祖细胞;发现 MYCN 通过激活 MYC/E2F 与 mTORC1 通路驱动肿瘤，且 MYCN⁺细胞对 THZ1、Flavopiridol、Volasertib 特异性敏感。该模型复现临床 MYCN 扩增 RB 特征，为研究肿瘤起源与精准治疗提供工具。