新型半自动灌注技术高效分离小鼠原代肝细胞

研究背景

原代肝细胞是肝脏生理、病理及药物研发的核心工具，但传统分离依赖 1976 年 Seglen 建立的两步胶原酶灌注法，存在诸多痛点：门静脉插管技术要求高、胶原酶批次差异导致重复性差、在体灌注易污染、动物伦理审批严格。

德国米尔滕尼生物公司与亚琛工业大学合作团队在《Biomedicines》上发表题为Isolation of Hepatocytes from Liver Tissue by a Novel, Semi-Automated Perfusion Technology的研究，开发 gentleMACS 半自动灌注系统：以切除的肝叶为原料，无需插管，通过标准化酶解和机械解离，实现肝细胞快速、高纯度、高活力分离，符合动物实验 3R 原则(替代、减少、优化)，解决传统方法的核心缺陷。

实验方法

1. 核心实验材料

动物模型：不同品系小鼠(CD1、BALB/c、C57BL/6)，5-12 周龄，雌雄均有。

关键试剂：Liver Perfusion Kit(含酶 D/R/A、缓冲液 P 等标准化试剂)、肝细胞培养基(含 10% FBS、谷氨酰胺、青链霉素)。

核心设备：gentleMACS Octo Dissociator 加热版、gentleMACS Perfuser(灌注装置，含 Lid/Clamp/Grid/Base 组件)、gentleMACS C 管(解离用)、MACS SmartStrainer(100μm，过滤)。

检测工具：流式细胞仪、荧光显微镜、Western blot 系统、RT-PCR 仪、台盼蓝染色试剂盒。

2. 关键实验技术(半自动分离流程)

(1)装置与试剂准备

灌注装置组装：将 Perfusion Sleeves 安装到加热版解离仪，Perfuser Base-Lid 固定到仪器，预热至 37℃。

试剂配制：用试剂盒制备预消化缓冲液(无钙)、平衡缓冲液、酶消化混合液(酶 D/R/A + 平衡缓冲液)，均预热至 37℃。

(2)肝叶处理与固定

小鼠处死后，快速分离肝叶(优先左外侧叶)，PBS 冲洗后置于 Perfuser 的 Grid 中央，用 Clamp 固定。

将 Grid - 肝叶 - Clamp 组件与 Lid 连接，拧紧固定到 Base，装置的 4 根针头自动刺入肝组织。

(3)自动化灌注与酶解

运行预设程序(37C_m_LIPK_1)：依次完成预灌注(无钙缓冲液，洗去血液)、平衡灌注、酶消化灌注(10min)，程序自动暂停以更换缓冲液 / 酶液。

灌注过程中，肝组织颜色从红色(含血)变为苍白(洗去血液)，酶解后质地变软。

(4)肝细胞解离与纯化

酶解后，将肝叶转移至含酶消化液的 C 管，运行解离程序(LIPK_HR_1)5min，轻柔释放肝细胞。

细胞悬液经 100μm SmartStrainer 过滤，30×g 低温离心 5min，收集沉淀(肝细胞)，弃上清(含非实质细胞)。

(5)鉴定与功能验证

纯度 / 活力：台盼蓝排斥法检测活力，流式细胞仪验证纯度;

表型鉴定：免疫荧光 / Western blot 检测肝细胞标志物(CK8、ZO-1、HNF4α);

功能验证：RT-PCR 检测白蛋白(Alb)、HNF4α mRNA 表达，Western blot 检测 LCN2 分泌，IL-1β 刺激实验验证细胞敏感性。

关键结果

图1：gentleMACS 灌注装置结构

该图展示核心装置组成：(A-C)装置拆解为 Lid、Clamp、Grid、Base 四部分，Base 含内置蠕动泵和针头阵列，可精准输送液体;Lid 顶部的 Adjuster 可调节针头刺入深度，适配不同大小肝组织。结果表明，装置设计无需手动插管，简化操作流程。

图2：肝细胞分离完整操作流程

该图呈现分步操作：(A)装置组件;(B-C)肝叶固定到 Grid;(D-E)组件组装固定;(F)预设程序步骤;(G-H)手动更换缓冲液;(J-O)肝叶转移至 C 管解离;(P-Q)过滤离心获得肝细胞沉淀。结果显示，全程可在 3h 内完成，支持最多 8 个样本并行处理。

图3：肝组织灌注过程中的颜色变化

该图直观反映灌注效果：(A)灌注前肝叶呈红色(含血);(B)预灌注后变为苍白(血液洗净);(C)酶解后质地变软、颜色均匀。结果证实，灌注和酶解过程充分，组织解离完全。

图4：肝细胞形态学特征

该图显示培养后肝细胞形态：(2-24h)肝细胞贴壁生长，24h 后呈现典型的六边形扁平形态(100×/200×)，符合原代肝细胞的形态学标志。结果表明，分离的肝细胞保留正常贴壁和形态分化能力。

图5：肝细胞特异性标志物表达

该图验证表型纯度：(A)免疫荧光显示，肝细胞高表达 CK8(细胞骨架标志物)、ZO-1(紧密连接标志物)、HNF4α(肝细胞分化关键因子)，DAPI 染色显示核形态正常;(B)Western blot 证实上述标志物在分离肝细胞中稳定表达，与阳性对照(AML12 肝细胞系)一致。结果确认，分离细胞为高纯度肝细胞。

图6：肝细胞功能完整性验证

该图证明功能正常：(A)RT-PCR 显示，分离肝细胞与传统方法分离的肝细胞均高表达 Alb 和 HNF4α mRNA;(B)Western blot 显示，肝细胞可分泌 LCN2，且 IL-1β 刺激后分泌增加;(C)IL-1β 敏感性实验显示，分离肝细胞与传统方法分离的肝细胞对炎症刺激反应一致。结果证实，分离的肝细胞功能完整，可用于后续生理 / 病理研究。

全文总结

本研究的核心创新是开发半自动灌注分离系统，解决传统方法的核心痛点：1)技术优势：无需门静脉插管，操作门槛低，标准化试剂和程序减少人为误差，一次性耗材降低污染风险;2)伦理与效率：使用切除的肝组织，无需在体灌注，符合 3R 原则，无需复杂伦理审批，支持 8 个样本并行，提升实验效率;3)性能优势：肝细胞产量、纯度、活力稳定，表型和功能与传统方法一致，适配不同品系 / 年龄小鼠，可扩展至人类肝组织和疾病模型(如脂肪肝);4)应用价值：适用于药物代谢、肝疾病机制、类器官构建等研究，为原代肝细胞分离提供标准化解决方案。