肝癌小鼠中髓系来源抑制细胞（MDSC）对库普弗细胞表型与功能的调控

库普弗细胞是肝脏驻留巨噬细胞，作为抗肿瘤免疫的第一道防线，可通过抗原呈递启动特异性免疫应答。髓系来源抑制细胞(MDSC)是肿瘤微环境中关键的免疫抑制细胞，在肝癌(HCC)小鼠肝脏中大量浸润，但传统研究仅将 MDSC 归为粒细胞样和单核细胞样两个亚群，且其对库普弗细胞的具体调控作用尚不明确。

为此，瑞士日内瓦大学医院 的团队 在《OncoImmunology》上发表题为Impact of myeloid-derived suppressor cell on Kupffer cells from mouse livers with hepatocellular carcinoma的研究，首次在 HCC 小鼠模型中鉴定出三个具有独特表型和功能的 MDSC 亚群，并揭示其通过调控库普弗细胞的共刺激分子表达、细胞因子分泌及抗原呈递功能，抑制肝脏抗肿瘤免疫，为 HCC 免疫治疗提供新靶点。

实验方法

1. 核心实验材料

动物模型：C57BL/6 小鼠，通过肝被膜下注射 RIL-175 HCC 细胞构建肝癌模型;OT-I/OT-II 转基因小鼠用于 T 细胞增殖实验。

关键试剂：流式抗体(CD11b、Gr1、Ly6C、Ly6G、CD86、MHCII、CD274 等);磁珠分选试剂盒(Miltenyi Biotec);细胞因子 ELISA 试剂盒(IL-10、IL-1β、CCL2 等);脂多糖(LPS)、卵清蛋白肽(OVA323-339、OVA257-264)。

仪器设备：流式细胞仪(Beckman Coulter Cyan)、细胞分选仪(BioRad S3)、实时荧光定量 PCR 仪(BioRad CFX96)。

2. 关键实验技术

细胞分离与分选：通过体内肝脏灌注、密度梯度离心分离非实质细胞，磁珠分选结合流式分选获得纯库区普弗细胞(F4-80highMHCII+CD68lowLy6C-)和三个 MDSC 亚群(Ly6G+、Gr1+、Ly6C+)。

表型检测：流式细胞术分析库普弗细胞共刺激分子(CD86、MHCII)和共抑制分子(CD274)表达。

功能验证：抗原呈递实验(CFSE 标记 OT-II CD4+T 细胞与库普弗细胞共培养);MDSC 抑制实验(OT-I CD8+T 细胞增殖检测);细胞因子分泌检测(ELISA);qPCR 检测 MDSC 中 Nos2、Arg1 基因表达。

共培养实验：库普弗细胞与 MDSC 亚群共培养 24 小时，检测细胞因子分泌和表型变化。

关键结果

图1：HCC 小鼠库普弗细胞的表型改变

该图展示 HCC 对库普弗细胞表型的影响：(A)库普弗细胞分选策略(F4-80highMHCII+CD68lowLy6C-)，排除循环巨噬细胞和细胞 doublets;(B)与对照组相比，HCC 小鼠肿瘤周围肝组织中，库普弗细胞共刺激分子 CD86 和 MHCII 的平均荧光强度(MFI)显著降低，共抑制分子 CD274(PD-L1)显著升高，且该变化随肿瘤直径(>0.5cm)加剧。结果表明，HCC 微环境可诱导库普弗细胞呈现免疫抑制表型。

图2：HCC 小鼠库普弗细胞的抗原呈递功能下降

该图验证库普弗细胞的抗原呈递能力：(上)CFSE 标记的 OT-II CD4+T 细胞与库普弗细胞共培养后，增殖细胞(CFSElow)比例的流式图;(下)定量结果显示，HCC 来源的库普弗细胞诱导 CD4+T 细胞增殖的能力(12.1%)显著低于对照组(50.23%)，且 LPS 预处理会进一步降低其抗原呈递效率。结果证实，HCC 微环境导致库普弗细胞抗原呈递功能受损。

图3：MDSC 在 HCC 小鼠体内的分布与亚群特征

该图分析 MDSC 的体内分布：(A)HCC 小鼠第 21 天，血液和脾脏中 CD11b+Gr1+MDSC 比例显著高于对照组;(B)肝脏中 MDSC 数量从对照组、肿瘤周围组织到肿瘤组织逐渐升高(9.1:1→57.85:1→487:1，MDSC / 内皮细胞比值)，粒细胞样(Ly6G+CD11b+)和单核细胞样(Ly6C+CD11b+)亚群均扩张;(C)HCC 小鼠肝脏中，单核细胞样 MDSC 的 CCR2(CCL2 受体)表达显著升高。结果表明，HCC 可诱导 MDSC 在全身及肝脏局部富集，且单核细胞样 MDSC 可能通过 CCL2/CCR2 通路招募至肝脏。

图4：HCC 小鼠中三个 MDSC 亚群的鉴定与功能

该图首次鉴定三个 MDSC 亚群：(A)流式分选图谱显示三个 CD11b + 亚群(Ly6G+、Gr1+、Ly6C+);(B)表型分析显示，Gr1 + 和 Ly6C + 亚群高表达 CCR2、CD244、CD115，Ly6G + 亚群低表达这些分子;(C)三个亚群均能抑制 OT-I CD8+T 细胞增殖，且抑制能力随 MDSC 比例升高而增强;(D)qPCR 显示，Ly6G + 亚群高表达 Nos2，Gr1 + 和 Ly6C + 亚群高表达 Arg1;(E)形态学显示，Ly6C + 亚群贴壁后形成伪足，分化程度更高;(F)LPS 刺激后，Ly6C + 亚群 MHCII 表达比例(43.3%)高于 Gr1 + 亚群(22%)。结果证实，三个 MDSC 亚群具有独特表型和免疫抑制功能。

图5：MDSC 亚群对库普弗细胞分泌功能和内吞的影响

该图展示共培养后库普弗细胞的功能变化：(A)ELISA 结果显示，与 MDSC 亚群共培养后，库普弗细胞的 CCL2 和 IL-18 分泌降低，IL-10 和 IL-1β 分泌升高(Ly6C + 亚群作用最显著)，IL-6 分泌无明显变化;(B)流式检测显示，MDSC 亚群对库普弗细胞的葡聚糖内吞能力无显著影响。结果表明，MDSC 主要调控库普弗细胞的细胞因子分泌谱，而非内吞功能。

图6：MDSC 亚群对库普弗细胞表型和抗原呈递的调控

该图验证 MDSC 对库普弗细胞功能的影响：(A)共培养后，库普弗细胞的 CD86、MHCII 和 CD274 表达均显著升高;(B)预处理后的库普弗细胞诱导 CD4+T 细胞增殖的能力显著下降(Ly6G + 亚群降至 35.3%，Gr1 + 亚群降至 26.5%，Ly6C + 亚群降至 32.1%)，且加入抗 PD-L1、抗 IL-10 抗体或 COX-2 抑制剂无法逆转该抑制效应。结果表明，MDSC 可进一步调控库普弗细胞的共刺激 / 共抑制分子表达，增强其免疫抑制表型。

全文总结

本研究的核心贡献在于首次发现 HCC 小鼠肝脏中存在三个功能独特的 MDSC 亚群，并揭示其对库普弗细胞的调控机制：1)HCC 微环境诱导库普弗细胞表型(CD86/MHCII 降低、CD274 升高)和功能(抗原呈递减弱)异常，形成免疫抑制状态;2)鉴定出 Ly6G+、Gr1+、Ly6C + 三个 MDSC 亚群，均具有 T 细胞抑制能力，但依赖不同分子(Ly6G + 依赖 Nos2，Gr1+/Ly6C + 依赖 Arg1);3)MDSC 通过调控库普弗细胞的细胞因子分泌(促进 IL-10/IL-1β，抑制 CCL2/IL-18)和共刺激分子表达，进一步增强其免疫抑制特性，阻碍肝脏抗肿瘤免疫。