人源化抗 CD147 抗体 HuM6-1B9 激活 NK 细胞介导 ADCC，克服三阴性乳腺癌免疫耐药

三阴性乳腺癌(TNBC)因缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体 2(HER2)表达，无有效靶向治疗药物，临床预后极差，且常通过高表达 MHC class I(自然杀伤细胞 NK 的关键抑制配体)逃避免疫杀伤。CD147 作为一种跨膜糖蛋白，在 TNBC 中高表达，与肿瘤进展、免疫逃逸密切相关。此前，人源化抗 CD147 抗体 HuM6-1B9 已在 T 细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中展现出抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)效应，但在 TNBC 中能否通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)激活 NK 细胞，仍不明确。

泰国清迈大学的团队在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上发表题为Overcoming NK cell resistance in triple‑negative breast cancer via adcc with a humanized anti‑CD147 antibody的研究，证实 HuM6-1B9 可通过强结合 CD147 增强外周血单个核细胞(PBMC)及 NK 细胞介导的 ADCC，即使在高 MHC class I 表达的 TNBC 中仍能高效诱导肿瘤细胞凋亡，且不促进肿瘤转移，为 TNBC 免疫治疗提供了新的候选药物。

实验方法

细胞培养与抗体制备：培养多种乳腺癌细胞系，包括激素受体阳性的 MCF7、HER2 阳性的 MDA-MB-453，以及 TNBC 细胞 MDA-MB-231 和 HCC38;利用 HEK293T 细胞转染 pVITRO1-HuM6-1B9-IgG1/κ 质粒，经潮霉素筛选、无血清培养基适应后，通过 HiTrap™ Protein G 亲和层析纯化 HuM6-1B9 抗体。

结合亲和力与表面分子检测：采用流式细胞术，以 PE 标记的二抗检测 HuM6-1B9 与各乳腺癌细胞系的结合情况，计算解离常数(Kₐ);同时用 FITC 标记的二抗检测细胞表面 CD147、CD146、CD73 及 MHC class I 的表达，通过 FlowJo 软件分析几何平均荧光强度(gMFI)。

ADCC 活性评估：在 3D Matrigel 体系中培养 MDA-MB-231 细胞形成肿瘤球(spheroids)，与 PBMC 共培养(加入 HuM6-1B9 或人免疫球蛋白 G(hIgG)作为对照)，通过 PrestoBlue™试剂盒检测细胞活力，LIVE/DEAD™染色量化死亡细胞比例;用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞，与纯化的 NK 细胞按效应细胞：靶细胞(E:T)=3:1 共培养，碘化丙啶(PI)染色后通过流式细胞术检测死亡靶细胞(CFSE⁺PI⁺)比例，评估 NK 细胞介导的 ADCC 效应。

机制与安全性验证：通过流式细胞术检测 NK 细胞表面 CD107a(脱颗粒标志)的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中干扰素 -γ(IFN-γ)的分泌量;采用抗 CD16 抗体预处理 NK 细胞进行 FcγRIII 阻断实验，验证 ADCC 的作用机制;通过 Transwell 实验检测 HuM6-1B9 对 MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力的影响;利用活细胞成像技术观察 caspase-3/7 的激活情况，判断肿瘤细胞凋亡水平。

关键结果

图1：乳腺癌细胞系表面分子表达差异

流式细胞术结果显示，CD147 在所有检测的乳腺癌细胞系中均有表达，其中 HCC38 细胞的 gMFI 最高;CD146 仅在 TNBC 细胞(MDA-MB-231、HCC38)中检测到，在 MCF7 和 MDA-MB-453 细胞中未表达;CD73 在 MDA-MB-231 细胞中高表达，在 MCF7 和 HCC38 细胞中表达极低;MHC class I 在 TNBC 细胞中的表达水平最高(HCC38>MDA-MB-231)，提示 TNBC 可能通过高表达 MHC class I 实现免疫逃逸。

图2：HuM6-1B9 对乳腺癌细胞的高结合亲和力

HuM6-1B9 对所有检测的乳腺癌细胞系均表现出强结合能力，解离常数(Kₐ)范围为 4.523-7.910 nM，其中对 HCC38 细胞的结合亲和力最高(Kₐ=4.523 nM)，其次是 MDA-MB-231(Kₐ=4.982 nM)、MCF7(Kₐ=5.842 nM)和 MDA-MB-453(Kₐ=7.910 nM)，结合亲和力与细胞表面 CD147 的表达水平一致，证实 HuM6-1B9 对 CD147 的靶向特异性。

图3：HuM6-1B9 增强 PBMC 介导的 TNBC spheroids 杀伤

在脂多糖(LPS)诱导的 TNBC 肿瘤球模型中，HuM6-1B9 处理组的肿瘤球活力较对照组降低 40%(P<0.001);LIVE/DEAD™染色结果显示，HuM6-1B9 处理组的红色(死亡细胞)/ 绿色(活细胞)荧光强度比是对照组的 3 倍;共聚焦显微镜成像可见，HuM6-1B9 处理后肿瘤球结构明显破坏，证实 HuM6-1B9 可显著增强 PBMC 介导的 ADCC 效应。

图4：HuM6-1B9 克服 TNBC 的 NK 细胞耐药

在无抗体处理时，MDA-MB-231 细胞对 NK 细胞杀伤表现出明显耐药性，死亡率仅为 10%，而 HuM6-1B9 处理后其死亡率提升至 50%;HCC38 细胞的死亡率从 20% 升至 70%，MCF7 和 MDA-MB-453 细胞的死亡率也显著升高;hIgG 对照组的肿瘤细胞死亡率无明显变化，证实 HuM6-1B9 可特异性增强 NK 细胞介导的 ADCC，克服 TNBC 的 NK 细胞耐药。

图5：HuM6-1B9 促进 NK 细胞活化与细胞因子分泌

HuM6-1B9 处理组的 NK 细胞中，CD107a⁺细胞(脱颗粒标志)比例较对照组提升 2.5 倍(P<0.0001);培养上清中 IFN-γ 的浓度达 120 pg/mL，是 hIgG 对照组的 6 倍;仅 NK 细胞与 HuM6-1B9 共培养时，IFN-γ 分泌量极低，表明 HuM6-1B9 对 NK 细胞的活化依赖于与靶细胞的结合。

图6：HuM6-1B9 诱导 TNBC 凋亡

活细胞成像结果显示，HuM6-1B9 处理 6 小时后，TNBC 细胞中 caspase-3/7⁺细胞(绿色荧光，凋亡标志)比例达 35%，是对照组的 7 倍;凋亡率随处理时间(0-6 小时)和 HuM6-1B9 浓度(0.01-10 μg/mL)的增加而升高，呈时间 - 浓度依赖性，证实 HuM6-1B9 通过 ADCC 效应诱导 TNBC 细胞凋亡。

图7：ADCC 依赖 FcγRIII，且不与 PD-1 抑制剂协同

FcγRIII 阻断实验结果显示，抗 CD16 抗体预处理 NK 细胞后，HuM6-1B9 介导的 ADCC 效率下降 60%(P<0.01)，证明 HuM6-1B9 通过 Fc 段与 NK 细胞表面 FcγRIII(CD16)相互作用发挥 ADCC 效应;HuM6-1B9 处理不影响 TNBC 细胞表面 MHC class I 相关蛋白 A/B(MIC-A/B)的表达;将 HuM6-1B9 与抗 PD-1 抗体(pembrolizumab)联合使用，ADCC 效率无额外提升，推测可能与静息 NK 细胞表面 PD-1 表达水平低有关。

图8：HuM6-1B9 不影响 TNBC 迁移与侵袭

Transwell 实验结果显示，1-10 μg/mL HuM6-1B9 处理后，MDA-MB-231 细胞的迁移细胞数、侵袭细胞数与对照组(hIgG 或培养基)无显著差异(P>0.05)，证明 HuM6-1B9 不促进 TNBC 细胞的迁移和侵袭，安全性良好。

全文总结

本研究证实，人源化抗 CD147 抗体 HuM6-1B9 通过三大核心机制发挥抗 TNBC 作用：1)高亲和力结合 TNBC 细胞表面的 CD147(Kₐ=4.523-7.910 nM)，显著增强 PBMC 及 NK 细胞介导的 ADCC 效应，即使在高 MHC class I 表达的 TNBC 中仍能实现 50%-70% 的肿瘤细胞杀伤;2)通过 Fc-FcγRIII 相互作用激活 NK 细胞，促进其脱颗粒(CD107a⁺)和 IFN-γ 分泌，进而诱导肿瘤细胞凋亡;3)不影响 TNBC 细胞的迁移和侵袭能力，且不干扰 MIC-A/B 介导的内源性 NK 细胞识别，安全性良好。该研究为 TNBC(尤其 NK 细胞耐药亚型)提供了安全高效的免疫治疗候选药物，后续需通过体内动物模型进一步验证其临床转化潜力。