CD40LG与ANXA5构象变化作为2,7-二溴咔唑诱导心肌毒性关键事件的体内与体外模型研究

基本信息

英文标题：Conformation of CD40LG and ANXA5 as Key Events of 2,7-Dibromocarbazole-Induced Cardiotoxicity Using in Vivo and in Vitro Models

中文标题：CD40LG与ANXA5构象变化作为2,7-二溴咔唑诱导心肌毒性关键事件的体内与体外模型研究

发表期刊：《Environmental Science & Technology》

影响因子：11.3

作者单位：

浙江树人大学

中国科学院生态环境研究中心

浙江工业大学

中国农业科学院茶叶研究所

挪威斯塔万格大学

美国加州大学河滨分校

作者信息：

Chenyang Ji, Jiahui Miao, Xinru Wang, Ziyan Cheng, Mengye Zhang, Meirong Zhao, Daniela M. Pampanin,* Daniel Schlenk, and Yang Song*

研究背景

研究背景：

多卤代咔唑(PHCZs)是一类新兴的二噁英类似物(DLCs)，具有持久性、生物累积性和潜在毒性。它们在环境(如沉积物、水体、生物样本)中广泛存在，其浓度在某些地区甚至超过多氯联苯(PCBs)。尽管已有研究表明，二噁英类似物的心脏毒性通常以芳烃受体(AhR)激活为分子起始事件(MIE)，但针对PHCZs诱导心脏毒性的下游关键事件(KEs)及其调控网络尚不明确。2,7-二溴咔唑(2,7-DBCZ)作为一种典型的PHCZs，其心脏毒性机制亟待深入研究。

研究创新点：

本研究首次系统揭示了2,7-DBCZ通过AhR激活，引发下游CD40LG和ANXA5表达上调，进而扰乱Akt信号通路与细胞内Ca²⁺稳态，最终诱导心肌细胞凋亡的分子机制。研究不仅明确了CD40LG和ANXA5作为AhR激活后调控心脏毒性的关键下游事件，还构建了“AhR-CD40LG/ANXA5-Ca²⁺/Akt-细胞凋亡”的级联通路，为评估PHCZs这类新兴污染物的生态与健康风险提供了关键的作用模式(MOA)数据和毒性通路证据。

研究方法

1.动物实验：

模型：使用Sprague-Dawley(SD)大鼠。

暴露方式：通过灌胃给予不同剂量(100 μg/kg/d 和 100 mg/kg/d)的2,7-DBCZ，持续14天。

指标：通过TUNEL染色检测心脏组织细胞凋亡;使用气相色谱-质谱联用(GC-MS/MS)检测心脏组织中2,7-DBCZ的残留量。

2.细胞实验：

细胞模型：大鼠心肌细胞(H9c2细胞)。

暴露浓度：10⁻⁵ M 2,7-DBCZ处理48小时。

细胞活力检测：采用MTS法。

细胞凋亡检测：采用Annexin V/PI双染结合流式细胞术。

线粒体膜电位(MMP)检测：采用JC-1染色。

基因表达与通路分析：

凋亡相关基因表达谱：采用凋亡相关PCR芯片，检测84个关键凋亡基因的表达变化。

生物信息学分析：使用** ingenuity通路分析(IPA)** 软件，对差异表达基因(DEGs)进行核心通路富集和上游调控因子预测。

3.关键分子验证：

Akt信号通路：通过Western blot检测Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平;通过qRT-PCR检测Akt通路相关基因(AKT1, AKT2, DHPR等)的表达。

细胞内Ca²⁺水平：使用Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内Ca²⁺浓度。

抑制剂/激活剂预处理：使用Akt激活剂(SC79)和Ca²⁺抑制剂(BAPTA-AM)预处理细胞，反向验证Akt和Ca²⁺在凋亡中的作用。

基因沉默：通过siRNA技术沉默Ppp2ca(编码Akt去磷酸化酶PP2A的基因)，进一步确认Akt磷酸化的调控机制。

4.AhR通路验证：

使用AhR拮抗剂(CH-223191) 与2,7-DBCZ、TCDD(2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英，阳性对照)和PCB 126(3,3‘,4,4’,5-五氯联苯，阳性对照)进行共处理。

通过qRT-PCR检测AhR下游标志基因(CYP1A1， CYP1B1)及关键基因(CD40LG, ANXA5)的表达变化，以确认CD40LG和ANXA5是否为AhR激活后的下游关键事件。

实验结果

图1 | 2,7-DBCZ诱导大鼠心脏组织及H9c2细胞凋亡

(A)不同实验组大鼠心脏组织的TUNEL染色(比例尺=2000 μm)。(B)不同实验组大鼠心脏组织细胞凋亡比例。(C)2,7-DBCZ诱导H9c2细胞凋亡。Q1象限：机械损伤细胞(AV⁻/PI⁺);Q2象限：晚期凋亡细胞(AV⁺/PI⁺);Q3象限：早期凋亡细胞(AV⁺/PI⁻);Q4象限：正常细胞(AV⁻/PI⁻)。

图2 | 2,7-DBCZ暴露后凋亡相关基因表达谱紊乱及转录组学分析

(A)热图显示与对照组相比，2,7-DBCZ暴露48小时后凋亡相关基因的相对表达变化。(B)2,7-DBCZ暴露后的差异表达基因(DEGs)。(C)2,7-DBCZ暴露后凋亡相关基因的火山图。(D)IPA预测的对照组与2,7-DBCZ暴露组之间排名前20的富集经典通路。(E)IPA预测的2,7-DBCZ暴露组中对凋亡信号通路有贡献的基因。(F)上游调控子网络图，显示了上游调控子与数据集中直接相关且共存的靶基因之间的相互作用。(G)与CD40LG在凋亡信号通路中作用相关的基因互作网络图。

图3 | 2,7-DBCZ扰乱Akt信号通路和细胞内Ca²⁺浓度

(A)Western blot检测H9c2细胞中Akt和p-Akt水平。GAPDH作为上样对照。(B)H9c2细胞中p-Akt/Akt的相对比例。(C)Akt信号通路相关基因的相对mRNA表达水平。(D)H9c2细胞中Fluo-3 AM荧光的平均强度。

图4 | 验证Akt和Ca²⁺在调控2,7-DBCZ诱导的H9c2细胞凋亡中的作用

(A)Western blot检测SC79/BAPTA-AM预处理后，2,7-DBCZ暴露组H9c2细胞中Akt和p-Akt水平。(B)H9c2细胞中p-Akt/Akt的相对比例。(C)SC79/BAPTA-AM预处理后，2,7-DBCZ暴露组H9c2细胞中Fluo-3 AM荧光的平均强度。(D)RNAi后，与对照组相比，2,7-DBCZ对H9c2细胞的细胞毒性。(E)RNAi后，与对照组相比，H9c2细胞中Fluo-3 AM荧光的平均强度。

图5 | AhR拮抗剂(CH-223191)共处理后，qRT-PCR验证AhR激活及其下游基因表达

研究结论

1.心脏毒性确认：2,7-DBCZ在体内(SD大鼠)和体外(H9c2细胞)均能诱导心肌细胞凋亡，并导致线粒体膜电位下降。

2.关键分子事件识别：2,7-DBCZ暴露显著上调了CD40LG和ANXA5的表达。IPA分析揭示“凋亡信号通路”是最显著富集的通路，且CD40LG处于核心调控位置。

3.信号通路交叉对话：2,7-DBCZ扰乱了Akt信号通路(增加p-Akt水平)和细胞内Ca²⁺稳态(增加Ca²⁺浓度)。使用Akt激活剂(SC79)或Ca²⁺抑制剂(BAPTA-AM)均可逆转细胞凋亡，表明两者在凋亡调控中存在交叉对话。进一步研究提示，Ca²⁺可能通过调控Akt磷酸化参与该过程。

4.上游调控机制：2,7-DBCZ、TCDD和PCB 126均能激活AhR，并诱导其下游标志基因(CYP1A1, CYP1B1)及CD40LG和ANXA5的表达。使用AhR拮抗剂(CH-223191)可同时抑制这些基因的表达，表明CD40LG和ANXA5是AhR激活后调控心脏毒性的下游关键事件。

科学意义：本研究首次构建了2,7-DBCZ诱导心脏毒性的“AhR激活 → CD40LG/ANXA5表达上调 → Ca²⁺/Akt信号紊乱 → 心肌细胞凋亡”的分子调控网络。该发现不仅为阐明新兴污染物PHCZs的毒性机制提供了关键的“作用模式”(MOA)数据，而且明确了CD40LG和ANXA5作为AhR下游关键事件(KEs)的地位，为建立基于有害结局路径(AOP)框架的风险评估提供了重要的权重证据(WoE)，对于这类持久性污染物的环境监管和风险评估具有重要的科学价值。

文献意义:

本研究首次构建了2,7-DBCZ诱导心脏毒性的“AhR激活 → CD40LG/ANXA5表达上调 → Ca²⁺/Akt信号紊乱 → 心肌细胞凋亡”的分子调控网络。该发现不仅为阐明新兴污染物PHCZs的毒性机制提供了关键的“作用模式”(MOA)数据，而且明确了CD40LG和ANXA5作为AhR下游关键事件(KEs)的地位，为建立基于有害结局路径(AOP)框架的风险评估提供了重要的权重证据(WoE)，对于这类持久性污染物的环境监管和风险评估具有重要的科学价值。