酒精相关性肝炎诊断新突破！胆汁酸谱成精准区分关键标志物！

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Disordered Bile Acid Metabolism in Alcohol-Related Hepatitis

中文标题：酒精相关性肝炎中的胆汁酸代谢紊乱

发表期刊：《Alimentary Pharmacology & Therapeutics》

影响因子：6.7

作者单位：

1.Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, London, UK

2.Imperial College Healthcare NHS Trust, St Mary's Hospital, The Liver Unit, London, UK

3.GSK, Brentford, UK

4.Cambridge NIHR Biomedical Research Centre, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, UK

5.Department of Hepatology, Royal Derby Hospital, Derby, UK

作者信息：

第一作者：Luke D. Tyson

通讯作者：Luke D. Tyson*

研究背景

酒精相关性肝炎(AH)是最严重的酒精相关性肝病(ARLD)，以急性黄疸和肝功能障碍为特征，90 天死亡率高达 30%，其黄疸病因与肝内胆汁淤积密切相关，但具体机制尚未明确。目前 AH 的诊断主要依赖临床标准，易与失代偿性酒精相关性肝硬化(DC)混淆，而肝活检作为确诊手段并非普遍可用且存在并发症风险，亟需可靠的血清诊断生物标志物。已有研究表明 AH 患者血清胆汁酸(BA)存在紊乱，但缺乏与 DC 及健康对照(HC)的系统性对比，且胆汁酸代谢紊乱的调控机制仍不清楚。本研究的主要目的是明确 AH 患者的血清胆汁酸谱特征，评估其作为 AH 诊断生物标志物的潜力;次要目的是探索 AH 中胆汁酸代谢紊乱的潜在分子机制，为开发新的治疗靶点提供依据。

研究方法

本研究采用两个独立队列(队列 1：164 例 AH、63 例 DC、36 例 HC;队列 2：94 例 AH、175 例 DC、72 例 HC)，通过超高效液相色谱 - 质谱联用(UHPLC-MS/MS)定量检测血清和粪便中的胆汁酸水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清成纤维细胞生长因子 19(FGF19)浓度;利用肝活检组织的 RNA 测序数据分析胆汁酸转运体及相关酶的基因表达，并与血清胆汁酸浓度进行相关性分析;通过多重免疫测定技术定量检测血清中细胞因子、生长因子等蛋白水平;将原代人肝细胞(PHH)与不同浓度的肝细胞生长因子(HGF)或 IL-8 共培养，采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测胆汁酸转运体的表达变化。统计学分析采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行组间差异筛选，通过受试者工作特征曲线(AUROC)评估生物标志物诊断效能，采用 Mann-Whitney U 检验、Spearman 秩相关分析等进行组间比较和相关性分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图1：胆汁酸谱可区分酒精相关性肝炎与失代偿性肝硬化及健康对照

队列 1 的非靶向 UHPLC-MS 分析和队列 2 的定量 UHPLC-MS/MS 分析均显示，PCA 和 OPLS-DA 模型可清晰区分 AH、DC 和 HC 三组的胆汁酸谱(队列 1 OPLS-DA 模型 F=24.9，p=6.15E-31;队列 2 F=35.2，p=4.27E-31)。变量重要性投影(VIP)评分显示，组间差异主要由结合型初级胆汁酸驱动，包括牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、甘胆酸(GCA)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)。敏感性分析表明，年龄、BMI、胆红素、抗生素使用等因素不影响胆汁酸谱的组间差异，证实 AH 的胆汁酸谱具有疾病特异性。

图2：AH 患者血清结合型初级胆汁酸显著升高

队列 2 的定量分析显示，AH 患者的总血清胆汁酸浓度显著高于 DC 和 HC(中位数 186.0 μM vs. 64.5 μM vs. 5.0 μM)，且差异主要源于结合型初级胆汁酸的升高(182.0 μM vs. 54.0 μM vs. 2.2 μM);而未结合型初级胆汁酸在 DC 中浓度最高，AH 与 HC 无显著差异。纵向分析显示，AH 患者经治疗后(D0 至 D28)，总血清胆汁酸和结合型初级胆汁酸浓度下降，未结合型初级胆汁酸浓度升高，与临床应答(Lille 应答)相关。

图3：AH 患者粪便胆汁酸水平降低

定量检测显示，AH 患者的总粪便胆汁酸浓度显著低于 DC 和 HC(中位数 0.47 mg/g vs. 1.11 mg/g vs. 2.64 mg/g)，且以次级胆汁酸的降低最为显著。关键血清胆汁酸(如 GCA、TCA)在粪便中也呈低水平表达，表明 AH 患者存在胆汁酸排泄障碍，肠道菌群介导的胆汁酸转化过程受损。

图4：AH 患者血清 / 粪便胆汁酸比值呈现特异性变化

对队列 2 中配对样本的分析显示，AH 患者的结合型初级胆汁酸血清 / 粪便比值显著高于 DC 和 HC，而未结合型初级胆汁酸的该比值则低于 DC 和 HC。这一差异反映了 AH 患者胆汁酸在肝脏摄取和排泄过程中的选择性障碍，结合型胆汁酸因依赖转运体跨膜而 “滞留” 于血清中，未结合型胆汁酸可通过被动扩散继续转运。

图5：FGF19 升高且胆汁酸转运体表达异常

AH 患者的血清 FGF19 浓度显著高于黄疸型 DC(胆红素 > 80 μmol/L)和非黄疸型 DC(5835 pg/mL vs. 865 pg/mL，p<0.001);肝组织 RNA 测序显示，CYP7A1(胆汁酸合成限速酶)表达低于检测下限，提示胆汁酸合成受抑制。相关性分析表明，血清结合型初级胆汁酸浓度与钠 - 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP，主要胆汁酸摄取泵)表达呈负相关(Spearman's rho=-0.432，p=0.031)，与多药耐药相关蛋白 4(MRP4，替代性胆汁酸输出泵)表达呈正相关(rho=0.538，p=0.006)，证实 AH 患者存在胆汁酸转运体表达紊乱。

图6：HGF 升高抑制肝细胞 BSEP 表达

多重免疫测定显示，AH 患者血清中 IL-8、HGF 和 IL-1RA 浓度显著高于 DC(p<0.001)，其中 HGF 浓度与血清结合型初级胆汁酸呈正相关(rho=0.305，p=0.003)，与未结合型初级胆汁酸呈负相关(rho=-0.292，p=0.005)。原代人肝细胞实验表明，以 AH 患者血清中中位数浓度(8.0 ng/mL)的 HGF 处理后，胆汁盐输出泵(BSEP，主要胆汁酸排泄泵)表达显著降低(0.44 vs. 对照组 1.00，p=0.002)，NTCP 表达呈下降趋势，而白蛋白表达无变化，证实 HGF 可特异性抑制胆汁酸转运体表达。IL-8 处理则对转运体表达无显著影响。

图7：AH 患者胆汁酸代谢紊乱的机制示意图

综合以上结果，提出 AH 中胆汁酸代谢紊乱的核心机制：AH 患者肝细胞 NTCP 和 BSEP 表达降低，结合型初级胆汁酸因依赖转运体跨膜而滞留于血清，导致血清浓度升高;未结合型胆汁酸可通过被动扩散转运，故血清浓度无显著升高;肠道胆汁酸排泄减少，粪便胆汁酸水平降低;血清 FGF19 升高抑制 CYP7A1 表达，胆汁酸合成减少;HGF 等炎症因子进一步抑制 BSEP 表达，加剧胆汁淤积，形成恶性循环。

研究结论

本研究通过两个大样本队列系统揭示了酒精相关性肝炎(AH)独特的胆汁酸代谢谱：AH 患者血清总胆汁酸显著升高，且以结合型初级胆汁酸(GCA、TCA、GCDCA、TCDCA)的选择性积累为核心特征，粪便胆汁酸水平降低，血清 / 粪便胆汁酸比值呈现特异性变化。血清胆汁酸谱区分 AH 与失代偿性酒精相关性肝硬化(DC)的 AUROC 达 0.922-0.964，其中 GCA 和 TCA 作为诊断生物标志物，在胆红素匹配亚组中效能优于血清胆红素，具有重要临床应用价值。机制研究表明，AH 患者胆汁酸代谢紊乱源于肝细胞胆汁酸转运体(NTCP、BSEP)表达降低，而非胆汁酸合成增加(CYP7A1 表达受抑、FGF19 升高);血清中升高的肝细胞生长因子(HGF)可直接抑制原代人肝细胞的 BSEP 表达，是导致转运体功能异常的关键调控因子。本研究明确了 AH 胆汁酸代谢紊乱的特征及分子机制，为 AH 的诊断提供了新型生物标志物，同时提示 HGF-BSEP 通路可能成为改善 AH 胆汁淤积的潜在治疗靶点。