恒河猴特异性无胸腺依赖人工胸腺类器官：支持造血干祖细胞完整胸腺发育的体外平台

T 细胞发育依赖造血干祖细胞(HSPCs)在胸腺中的逐步分化，其体外模拟对免疫治疗研发、免疫相关疾病机制解析至关重要。尽管小鼠和人类已建立成熟的体外 T 细胞生成体系，但非人灵长类(NHP，如恒河猴)模型仍存在关键缺口：传统方法需依赖原代胸腺基质细胞(来源有限、保存时间短)，或使用鼠源基质细胞(如 OP9-DLL1)，导致 T 细胞前体选择效率低、无法完整复现胸腺发育关键阶段(如 CD8+T 细胞生成不足、TCR 重排不完全)。而 NHP 作为临床前研究的重要模型，其生理相关性要求特异性 3D 系统支持完整胸腺发育。本研究开发的恒河猴特异性人工胸腺类器官(Rh-ATO)，通过工程化表达恒河猴 DLL1 的 MS5 基质细胞，构建无胸腺依赖的 3D 培养平台，填补了 NHP T 细胞发育体外模型的空白，为免疫再生策略、感染性疾病(如 HIV)治疗的预临床研究提供关键工具。

来自美国埃默里大学医学院病理与检验医学系、疫苗中心的团队在《bioRxiv》(预印本)上发表题为A thymus-independent artificial organoid system supports complete thymopoiesis from Rhesus macaque-derived hematopoietic stem and progenitor cells的研究。

核心内容如下：

1.MS5-Rh-DLL1 基质细胞构建

载体设计：慢病毒载体包含恒河猴 DLL1(Rh-DLL1)编码序列、eGFP 报告基因及嘌呤霉素抗性基因，分别由 MNDU3(Rh-DLL1)、IRES(eGFP)、mPGK(嘌呤霉素)启动子调控;

转导与筛选：将慢病毒转导至鼠源骨髓基质细胞系 MS5，用 5 μg/mL 嘌呤霉素筛选稳定细胞株，通过流式细胞术验证 Rh-DLL1 与 eGFP 共表达(阳性率 > 99%)，经支原体检测确认无污染物，获得可稳定传代的 MS5-Rh-DLL1 细胞。

2.Rh-ATO 构建与培养

HSPC 分离：从恒河猴骨髓中分离单个核细胞，通过磁珠分选富集 CD34 + 细胞，再经流式细胞术纯化 CD3-CD34+ HSPCs;

3D 聚合培养：将 CD3-CD34+ HSPCs 与 MS5-Rh-DLL1 按 1:20 的细胞比例混合，离心形成细胞聚集体，接种于 Millicell Transwell 插入式培养皿;培养基含 SCF(5 ng/mL)、IL-7(7.5 ng/mL)、FLT3 配体(7.5 ng/mL)及 L - 抗坏血酸(50 μM)，每 3-4 天更换新鲜培养基，持续培养 28 天。

3.检测与验证

胸腺发育阶段分析：在培养 7、14、28 天，通过流式细胞术检测胸腺细胞亚群标志物 —— 胸腺定植祖细胞(TSP：CD34+CD7+)、未成熟单阳性细胞(ISP：CD4+CD3-)、双阳性细胞(DP：CD4+CD8+)、单阳性细胞(SP：CD4+/CD8+)及近期胸腺迁出细胞(RTE：CD38+CD4/CD8+);

功能验证：通过流式细胞术检测成熟 T 细胞的 TCRαβ 表达;用佛波酯(PMA)+ 离子霉素刺激 T 细胞，结合胞内染色检测 IFNγ、TNFα、IL-2 的分泌情况，通过布尔分析评估细胞因子多效性;

跨物种验证：将人动员外周血 CD34+ HSPCs 接种于 Rh-ATO，培养 28 天后检测胸腺发育阶段标志物，验证系统的跨物种适用性。

关键结果

图 1：MS5-Rh-DLL1 基质细胞的构建与鉴定

该图验证工程化基质细胞的有效性与纯度：(A)展示慢病毒载体结构示意图，标注 Rh-DLL1、eGFP 报告基因及嘌呤霉素抗性基因的位置与调控启动子;(B-C)流式细胞术结果显示，转导后的 MS5 细胞中 Rh-DLL1 与 eGFP 共表达率 > 99%，未转导的 MS5 细胞无相关表达;(D)明场图像显示，经嘌呤霉素筛选后，仅转导细胞存活，未转导细胞全部死亡;(E)琼脂糖凝胶电泳结果证实，MS5-Rh-DLL1 细胞无支原体污染(无 434 bp 阳性条带)，确认该细胞可用于后续 Rh-ATO 构建，为类器官提供关键的 Notch 信号支持。

图 2：Rh-ATO 的建立与 T 细胞分化偏向性

该图证明 Rh-ATO 可定向支持 T 细胞谱系分化：(A)示意图展示 Rh-ATO 构建流程，包括 CD3-CD34+ HSPCs 与 MS5-Rh-DLL1 细胞聚合、3D Transwell 培养;(B)流式细胞术 gates 策略：从活细胞中圈选 CD45 + 淋巴细胞，再进一步分析 B 细胞(CD20+)、NK 细胞(CD56+)、T 细胞(CD3+);(C)定量结果显示，培养 28 天后，Rh-ATO 中 CD3+ T 细胞占 CD45 + 淋巴细胞的比例约 24%，显著高于 B 细胞(0.8%)与 NK 细胞(0.2%);(D)CD7 + 胸腺细胞中，90% 以上为 CD3+ T 细胞，极少向 B 细胞或 NK 细胞分化，证实 Rh-ATO 能模拟胸腺微环境的 T 细胞谱系定向信号。

图 3：Rh-ATO 产生 TSP 与 RTE 样细胞

该图对比 Rh-ATO 与体内胸腺、外周血的细胞表型一致性：(A-B)TSP 分析显示，恒河猴胸腺中 CD34+CD7 + 细胞占比约 66%，外周血中仅 1%，而 Rh-ATO 中该细胞比例从接种时的 18% 升至 28 天的 62%，接近体内胸腺水平;(C-F)RTE 分析显示，Rh-ATO 中 CD38+CD4+ T 细胞(80%)与 CD38+CD8+ T 细胞(85%)的比例，与胸腺中的对应细胞比例(75%、85%)高度一致，且显著高于外周血(32%、24%)，证明 Rh-ATO 不仅支持早期 T 细胞定植，还能生成具备近期胸腺迁出特征的成熟 T 细胞。

图 4：Rh-ATO 复现完整胸腺发育阶段

该图追踪胸腺发育时序并验证跨物种适用性：(A)恒河猴胸腺原位细胞的典型发育阶段，包括 ISP(CD4+CD3-)、DP(CD4+CD8+)、SP(CD4+/CD8+);(B-G)时间序列结果显示，培养 7 天时 ISP 占比 39%、DP 仅 3%;14 天时 DP 比例升至 10%、ISP 降至 23%，首次出现 CD3+ T 细胞(2%);28 天时 DP 占比达 36%、CD3+ T 细胞占 29%(其中 CD4+ SP 7%、CD8+ SP 34%)，完全复现 “ISP→DP→SP” 的体内胸腺发育轨迹;(H-I)人 CD34+ HSPCs 在 Rh-ATO 中同样可生成 ISP(15%)、DP(22%)、CD3+ T 细胞(26%)，证明系统具备跨物种适用性;(J)无 Rh-DLL1 的对照类器官无法产生 T 细胞，证实 Notch 信号是 T 细胞分化的关键驱动因素。

图 5：Rh-ATO 衍生 T 细胞的功能验证

该图确认 T 细胞的 TCR 表达与细胞因子分泌能力：(A-C)流式细胞术结果显示，培养 28 天后，约 15% 的 CD3+ T 细胞表达 TCRαβ，且 CD4+ SP 与 CD8+ SP 亚群的 TCRαβ 阳性率相近;(D-I)PMA + 离子霉素刺激后，54% 的 T 细胞可分泌至少一种细胞因子(单因子分泌细胞占 4%-15%、双因子分泌细胞占 37%、三因子分泌细胞占 9%)，未刺激组无显著细胞因子表达，证实 Rh-ATO 生成的 T 细胞具备功能性 TCR 重排及多效性细胞因子响应能力，符合生理状态下胸腺来源 T 细胞的功能特征。

全文总结

本研究首次成功构建恒河猴特异性无胸腺依赖人工胸腺类器官(Rh-ATO)，其核心价值体现在四方面：一是通过工程化表达恒河猴 DLL1 的 MS5 基质细胞，无需依赖原代胸腺组织即可提供持续的 Notch 信号，解决了传统模型中基质细胞来源有限、保存困难的问题;二是完整复现胸腺发育的关键阶段，从 CD34+CD7+ TSP 定植，到 ISP、DP 细胞分化，最终生成 CD3+TCRαβ+ CD4/CD8+ SP T 细胞，且 SP 细胞高表达 CD38，具备近期胸腺迁出细胞(RTE)表型，与体内胸腺发育高度一致;三是功能层面，Rh-ATO 衍生的 T 细胞可正常表达 TCRαβ，经刺激后能分泌 IFNγ、TNFα、IL-2 等细胞因子，展现出多效性免疫功能;四是具备跨物种适用性，可支持人 HSPC 的胸腺发育，为临床前研究提供 “人源化” 参考。