iPSC 衍生肝类器官：预测 AAV 基因治疗转导效率与安全性的新型体外平台

腺相关病毒(AAV)载体是体内基因治疗的核心递送工具，尤其在肝脏靶向治疗(如血友病 B)中应用广泛，已有 7 种 AAV 基因此疗产品获批上市。然而，预临床动物模型(小鼠、非人灵长类)与人类临床结果存在显著差异：部分患者出现载体相关肝毒性(如血清肝酶升高、capsid 特异性 T 细胞激活)，而这些毒性在动物模型中未出现;同时，不同 AAV 血清型的肝脏转导效率存在物种差异，传统体外模型(如 HepG2 细胞系)难以复现人类肝细胞的生理特性及供体间异质性，导致临床前评估准确性不足。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生肝类器官可模拟人类肝脏细胞组成与功能，且能体现供体差异，有望成为解决 AAV 转导效率与毒性预测难题的新型平台。

来自瑞士罗氏制药研发部、罗氏创新中心巴塞尔的团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表题为iPSC-hepatocyte organoids as a novel platform to predict AAV gene therapy efficacy的研究。

研究方法

1.肝脏模型构建与培养：培养两种肝细胞系(HepG2、NoSpin HepaRG)，HepG2 接种于 I 型胶原包被 flask 并传代 2 次，HepaRG 按厂商说明使用专用培养基培养并定期更换培养基;构建 iPSC 衍生肝类器官：采用 4 个供体的野生型 iPSC 肝细胞，96 孔板经 Matrigel 包被后，将细胞与 Matrigel 按 2:1 比例混合接种(8×10⁴细胞 / 孔)，添加 ROCK 抑制剂，每 2-3 天换液并每周补充 Matrigel，分化 14 天后用于实验。

2.AAV 处理与转导效率检测：使用 Sf9 细胞生产的 8 种 AAV 血清型(AAV1-9，除 AAV7)，均携带 GFP 报告基因(CMV 启动子)，经氯化铯超离心纯化;HepG2 达 80% 汇合后接种于 96 孔板，6 小时后加入含 AAV(MOI 10⁶)与去铁胺(DFO，抑制增殖)的培养基，连续 3 天用 Incucyte S3 成像;HepaRG 培养 7 天后加入含 AAV(MOI 10⁶)的维持培养基，同样成像 3 天;iPSC 肝类器官分化 14 天后加入含 AAV(MOI 10⁶)的新鲜培养基，28 天内用 Opera Phenix 系统成像，以 GFP 阳性细胞 / 类器官占比计算转导效率。

3.毒性与分子表征检测：以腺病毒(MOI 10)和氯丙嗪(150 μM)为肝毒性阳性对照，2 天后用分析仪检测培养上清中 AST 活性，72 小时后(细胞系)或 28 天后(类器官)用 CellTiter-Glo 3D 试剂盒检测 ATP 含量评估细胞活力;通过 RT-qPCR 检测肝特异性标志物(ALB、ASGR1/2、AAT)与胎儿标志物(AFP、LGR6)表达(内参基因 PPIB、B2M)，免疫荧光染色(ALB、ASGR1、AAT)验证肝细胞分化表型。

实验结果

图 1：AAV 在 HepG2 与 HepaRG 细胞系中的转导效率分析

(A)呈现 HepG2 中 AAV2、AAV8 及 HepaRG 中 AAV6、AAV8 转导后的相差显微镜与免疫荧光图像(Day1、Day3)，比例尺 200 μm，直观展示 GFP 阳性细胞分布;(B)为 3 天内两种细胞系中各 AAV 血清型的转导效率时序变化(均值 ± 标准差)，体现不同血清型的转导动力学差异;(C)热图呈现处理 3 天后各血清型在两种细胞系中的转导效率百分比，显示 HepG2 中 AAV2/3/6 转导效率最高(>54%)、AAV8/9 最低(<26%)，而 HepaRG 中所有血清型转导效率均超 50%，凸显细胞系选择对 AAV 转导评估的影响。

图 2：iPSC 衍生肝类器官的建立与表征

(A)示意图展示类器官培养流程，包括 Matrigel 包被、细胞接种、分化及检测时间节点;(B)相差显微镜图像呈现培养 Day2(细胞互联)、Day7、Day14 的类器官形态，比例尺 100 μm，显示类器官的自组装过程;(C)RT-qPCR 结果显示，随培养时间延长，肝成熟标志物(ALB、AAT、ASGR1/2)表达逐渐升高并在 Day14 后进入平台期，胎儿标志物(AFP、LGR6)表达降低，证实肝细胞分化成熟;(D)免疫荧光图像显示 Day14 类器官中 ALB、ASGR1、AAT 阳性表达，比例尺 100 μm，从蛋白水平验证肝细胞表型。

图 3：AAV 在 iPSC 衍生肝类器官中的转导效率分析

(A)展示两种供体类器官在不同 MOI(10⁴、10⁵、10⁶)下 AAV8/9 的转导效率(9 天内)，证实转导效率呈剂量依赖性，MOI 10⁶时最高;(B)呈现 MOI 10⁶下 AAV5/8 转导后 Day2、Day14、Day28 的相差显微镜与免疫荧光图像，比例尺 500 μm，显示 GFP 信号从 Day14 开始清晰可见并持续至 Day28;(C)为 4 个供体类器官在 MOI 10⁶下 28 天内的转导效率时序变化，显示转导效率在 7 天后进入平台期;(D)热图呈现 28 天后各血清型在 4 个供体类器官中的转导效率，显示 AAV4/5 效率最低(平均 <16%)、AAV2/6/8/9 效率最高(平均> 39%)，且供体间存在异质性但血清型转导趋势一致。

图 4：各肝脏模型中 AAV 的肝毒性评估

(A)展示处理 2 天后，HepG2、HepaRG 及 4 个供体类器官的 AST 释放水平(归一化至阴性对照)，阳性对照(腺病毒、氯丙嗪)AST 显著升高，而 AAV 处理组无显著变化;(B)呈现 4 个供体类器官 28 天内的 AST 释放时序变化，显示 AAV 处理组始终无显著升高，且供体对阳性对照的 AST 响应存在差异;(C)为 HepG2、HepaRG 处理 72 小时后的 ATP 含量(归一化至阴性对照)，氯丙嗪处理组 ATP 显著降低，AAV 处理组无显著变化;(D)显示类器官处理 28 天后的 ATP 含量，结果与细胞系一致，证实 AAV 在实验条件下无直接肝毒性。

全文总结

本研究通过对比肝细胞系(HepG2、HepaRG)与 iPSC 衍生肝类器官，评估 8 种 AAV 血清型的转导效率与急性肝毒性，核心发现包括：1)iPSC 肝类器官可成功分化为成熟肝细胞(ALB、AAT 阳性)，且能复现供体间异质性，转导效率趋势一致(AAV4/5 最低、AAV2/6/8/9 最高);2)HepG2 对 AAV8/9 转导效率低，而 HepaRG 与类器官更贴近临床 AAV 血清型(如 AAV8)的转导特征;3)所有测试 AAV 血清型在细胞系与类器官中均未诱导 AST 升高或 ATP 降低，无急性肝毒性。该研究证实 iPSC 肝类器官是预测 AAV 转导效率与安全性的可靠平台，可弥补传统细胞系的局限，助力 AAV 基因治疗的临床转化。局限性在于模型仅含肝细胞，缺乏肝脏非实质细胞(枯否细胞、星状细胞)与免疫细胞，无法模拟体内复杂微环境中的免疫相关肝毒性，未来需构建含多种细胞类型的类器官模型进一步优化。