漂浮子宫内膜类器官模型：体外复现上皮 - 基质细胞互作，助力生殖医学研究

传统子宫内膜类器官虽能模拟腺体结构并响应激素刺激，但存在核心局限 —— 缺乏基质细胞、血管及免疫细胞，无法复现体内上皮 - 基质细胞相互作用，难以模拟黄体中期子宫内膜的生理状态，限制了其在生殖医学(如胚胎着床机制)、不孕病因研究及药物筛选中的应用。现有类器官组装体(assembloids)虽尝试整合基质细胞，但需分步培养上皮与基质细胞后再组合，操作复杂且难以维持长期细胞互作。因此，亟需开发一种简单、高效且能自发保留上皮 - 基质细胞互作的子宫内膜类器官模型，以更精准模拟体内子宫内膜微环境。

来自意大利热那亚大学、国际福音医院的团队在《Experimental Cell Research》发表题为A FLOATING ENDOMETRIAL ORGANOID MODEL RECAPITULATES EPITHELIAL-STROMAL CELL INTERACTIONS IN VITRO的研究。

实验方法

1.样本获取与预处理

样本来源：收集 10 例接受辅助生殖技术治疗女性的子宫内膜活检组织(分泌期，排卵后 6-10 天)，部分样本经冷冻保存(-80℃);

腺体分离：组织经机械剪碎后，用 Dispase II(1.25 U/ml)+ 胶原酶 V(0.4 mg/ml)+DNA 酶 I(40 μg/ml)在 37℃消化 30-45 分钟，100 μm 滤网过滤获取腺体成分，滤液用于分离基质细胞。

2.两种子宫内膜类器官的构建

传统类器官(Conv-ORG)：腺体成分重悬于 Matrigel(1:20 体积比)，制成 20 μl 液滴接种于 48 孔板，凝固后加入 ExM 培养基(含 N2/B27 supplement、EGF、Noggin、R-spondin-1 等因子)，每 3-5 天换液，10-14 天传代;

漂浮类器官(Float-ORG)：腺体成分重悬于 Matrigel(1:20 体积比)，制成 30 μl 液滴置于 Parafilm 凹陷处凝固后，转移至含 10% FCS 的 DMEM/F12 培养基中悬浮培养，15-21 天观察形态成熟。

3.激素分化处理

传统类器官分化：先用 10 nM 17-β 雌二醇(E2)处理 48 小时，再用 10 nM E2+1 μM 孕酮(P4)+1 μM cAMP 处理 96 小时;

基质细胞分化：基质细胞在含 2% 去激素血清(DCC-FBS)的培养基中培养，血清饥饿后用 1 μM P4+0.5 mM cAMP 处理 3 天，qRT-PCR 验证 FOXO1、PRL 等分化标志物。

4.表型与分子检测

形态观察：明场显微镜记录类器官形态(囊性、中空结构);

免疫荧光：检测上皮标志物(E - 钙黏蛋白 CDH1、MUC1、乙酰化 α- 微管蛋白)、基质标志物(波形蛋白 VIM)、激素受体(ERα、PR)及增殖标志物(EdU)，使用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5/Stellaris 8 STED)成像;

qRT-PCR：检测 15 个子宫内膜 / 蜕膜标志物(CD133、FOXA2、OPN、LIF、COX-2 等)及细胞因子(IL1β、IL6、IL8、MCP1)，以 RPL13A/RPL19 为内参基因。

实验结果

图 1：传统子宫内膜类器官的生成与上皮特征验证

该图展示传统类器官的形态与分子特征：(A-B)明场图像显示传统类器官呈典型 “囊泡状” 中空结构(E#5 样本);(C-F)免疫荧光结果：CDH1(红色)阳性上皮细胞围绕 lumen 分布，仅少量 VIM(绿色)阳性基质细胞(C);ERα(红色)与干细胞标志物 CD133(绿色)共表达(D);MUC1(红色)在腺体表膜表达，VIM 阳性细胞稀疏(E);乙酰化 α- 微管蛋白(红色)标记纤毛，FOXA2(绿色)标记腺体转录因子(F)。图示传统类器官以上皮细胞为主，基质细胞极少，符合其 “上皮富集” 特性。

图 2：传统类器官的增殖与激素响应

该图验证传统类器官的功能特性：(A)EdU 增殖实验显示 CDH1 阳性上皮细胞(红色)大量掺入 EdU(绿色)，VIM 阳性细胞(青色)增殖微弱;(B)qRT-PCR 证实传统类器官高表达 CDH1，基质细胞高表达 VIM;(C)免疫荧光显示激素分化后(DIFF)MUC1、PAEP(红色)表达显著高于未分化组(CTR);(D-E)qRT-PCR 验证：所有样本分化后 MUC1 均上调，PAEP 在部分样本(如 E#5、E#6)无显著变化，体现患者间异质性。图示传统类器官上皮增殖活跃，且对激素有响应，但存在个体差异。

图 3：漂浮子宫内膜类器官的形态特征

该图展示漂浮类器官的典型形态：明场图像显示 3 个不同样本(E#7、E#2)的漂浮类器官呈圆形或长梭形中空结构，低倍镜下可见 Matrigel 液滴内细胞聚集形成分支状腺体样结构，高倍镜下清晰观察到中央 lumen 及外周细胞层。图示漂浮类器官无需复杂因子即可自发形成类似体内的腺体形态，且基质细胞未脱离类器官结构。

图 4：漂浮类器官的上皮 - 基质细胞共存验证

该图确认漂浮类器官的细胞组成：(A-C)免疫荧光显示 CDH1 阳性上皮细胞(红色)形成管状结构，VIM 阳性基质细胞(绿色)紧密分布于上皮细胞间或类器官内部，二者直接接触(C 图高倍镜);(D)EdU 增殖实验显示 CDH1 阳性上皮细胞(红色)掺入 EdU(绿色)，VIM 阳性基质细胞(青色)增殖不活跃。图示漂浮类器官成功保留上皮 - 基质细胞互作，且上皮细胞维持增殖能力。

图 5：漂浮类器官的腺体功能标志物表达

该图验证漂浮类器官的功能特征：(A-B)免疫荧光显示 MUC1(红色)在类器官内外上皮表面均有表达，VIM 阳性基质细胞(绿色)围绕上皮分布;(C-F)乙酰化 α- 微管蛋白(红色)标记的纤毛在类器官上皮细胞顶端富集(D-F 高倍镜)，证实存在功能性纤毛结构。图示漂浮类器官不仅保留上皮 - 基质互作，还具备腺体特有的分泌与纤毛功能。

图 6：两类器官的子宫内膜 / 蜕膜标志物表达对比

该图通过 qRT-PCR 对比基因表达差异：以传统未分化类器官(Conv-ORG CTR)为对照，漂浮类器官(Float-ORG)中 CD133(干细胞标志物)下调 2.9 倍，OPN(分泌标志物)上调 17 倍、PR(孕酮受体)上调 19.8 倍、COX-2(炎症相关)上调 11.9 倍，与传统分化类器官(Conv-ORG DIFF)的表达趋势一致，但部分基因(如 MUC1)表达低于传统分化组。图示漂浮类器官自发呈现分化表型，且关键蜕膜标志物表达更显著。

图 7：细胞因子表达的组间对比

该图分析细胞因子表达差异：与传统类器官(Conv-ORG CTR/DIFF)及基质细胞(STROMA CTR/DIFF)相比，漂浮类器官中 IL8、MCP1 表达显著升高(p<0.05)，IL1β、IL6 呈上升趋势。图示上皮 - 基质细胞互作可调控细胞因子分泌，漂浮类器官的细胞因子谱更接近体内微环境。

全文总结

本研究由意大利团队开发了一种简单高效的漂浮子宫内膜类器官模型，核心优势在于：1)无需复杂分化因子，仅通过 10% FCS 培养基即可自发形成中空腺体结构，且保留上皮 - 基质细胞直接接触;2)漂浮类器官自发呈现分化表型，OPN、PR 等蜕膜标志物表达显著高于传统类器官;3)上皮 - 基质互作调控细胞因子分泌，更贴近体内子宫内膜微环境。局限性包括：传代次数有限(仅 2 代)、无法精准控制分化步骤、未整合血管 / 免疫细胞。该模型为研究子宫内膜上皮 - 基质互作、胚胎着床机制及不孕病因提供了更生理化的体外工具，未来需优化培养条件以延长传代并整合更多细胞类型。