DVP 技术助力结肠类器官研究：验证原位移植类器官的体内样表型，为肠道再生医学提供新工具

炎症性肠病(IBD)等肠道疾病的治疗依赖肠上皮细胞(IECs)修复，结肠类器官移植是潜在方案，但体外培养类器官能否复现体内 IECs 功能表型尚不明确。传统技术如单细胞转录组缺乏空间信息、荧光原位杂交依赖预设靶点，难以捕捉原位细胞功能异质性。深度视觉蛋白质组学(DVP)整合 AI 成像分类、激光显微切割与高灵敏度质谱，可实现空间分辨蛋白质组分析，却未用于结肠类器官与体内组织的精准对比。本研究优化 DVP 技术，建立人结肠空间蛋白质组资源，验证原位移植类器官表型，探索培养条件对类器官成熟的调控，为肠道再生医学提供支撑。

来自丹麦哥本哈根大学、德国马克斯・普朗克生化研究所、瑞士苏黎世联邦理工学院的团队在《Cell Systems》发表题为Deep visual proteomics reveals an in vivo-like phenotype of orthotopically transplanted human colon organoids的研究。

核心内容如下：

DVP 与 scDVP 技术建立：收集健康人结肠组织、体外培养结肠类器官、NOG 小鼠原位移植类器官，冷冻切片后经 4% 多聚甲醛固定、免疫荧光染色(EPCAM 标记上皮细胞、CD45 标记免疫细胞、PDGFR 标记成纤维细胞);采用 Cellpose 进行单细胞分割，BIAS 软件基于标志物强度分类细胞，Leica LMD7 激光显微切割收集目标细胞轮廓;切割样本经裂解、胰酶消化后，通过 Evosep One 液相色谱耦合 Orbitrap Astral 质谱仪检测，以 UniProt 人蛋白质组数据库为参考进行蛋白鉴定与定量。

结肠类器官培养与原位移植：使用 LGR5-TdTomato 报告基因的人结肠类器官系，常规培养于含 WNR(WNT3a、Noggin、R-spondin-3)的 Advanced DMEM/F12 培养基，另设撤去 WNR、撤去 WNR 并添加 BMP4 的对照条件;类器官经细胞恢复液处理后输注至 EDTA 预处理的 NOG 小鼠结肠，6 周后收集移植组织，通过 GFP 标记定位人源类器官。

表型验证与信号调控分析：免疫荧光检测分化标志物与干细胞标志物，qPCR 检测 WNT/BMP 通路相关基因;采用 DIA-NN 软件处理质谱数据，Perseus 进行差异蛋白筛选与 PCA 分析，GSEApy 进行 GO 富集分析;scDVP 数据通过 UMAP 降维展示细胞聚类，LOWESS 曲线分析蛋白沿隐窝轴的表达梯度。

实验结果

图 1：DVP 技术流程与人结肠组织的空间蛋白质组验证

(A)展示从人结肠组织 / 类器官切片，经 AI 成像分类、激光显微切割到质谱检测的完整技术流程;(B)呈现人结肠黏膜中上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞的免疫荧光染色空间分布;(C)显示手动标注隐窝底部 / 上段、分割导出细胞轮廓，以 KRT20 为例展示蛋白空间分布;(D-E)呈现所有样本的蛋白 / 肽段鉴定数量、蛋白定量动态范围;(F-G)展示样本按上皮 / 固有层聚类的 PCA 结果及已知细胞类型标志物的表达情况，验证 DVP 对结肠组织细胞异质性与空间蛋白分布的捕捉能力。

图 2：体外类器官与体内 IECs 的蛋白质组相关性

(A)展示 LGR5-TdTomato 报告基因类器官的免疫荧光成像;(B)呈现体外类器官样本的 PCA 聚类结果;(C)展示不同上皮亚群标志物的表达丰度;(D)呈现体外类器官与体内隐窝细胞差异蛋白的相关性分析;(E)通过韦恩图展示体外与体内显著差异蛋白的重叠情况，验证体外类器官对体内结肠细胞关键特征的保留。

图 3：原位移植类器官的表型分析

(A)展示类器官原位移植到 NOG 小鼠结肠的实验流程;(B)呈现移植后类器官在小鼠结肠中的免疫荧光成像(GFP 标记人 IECs、LGR5 标记干细胞);(C)展示体外类器官、移植类器官与体内人结肠细胞的 PCA 聚类对比;(D)呈现三组样本显著差异蛋白的层级聚类热图;(E)展示差异蛋白的 GO 通路富集结果，分析移植后类器官功能通路的变化。

图 4：scDVP 解析结肠隐窝的分化梯度

(A)展示 scDVP 分析结肠隐窝 IECs 的技术概念;(B)呈现 499 个分离细胞的蛋白鉴定数量;(C)展示体外类器官、移植类器官与体内结肠黏膜的免疫荧光成像及细胞分割结果;(D)通过 LOWESS 曲线展示关键蛋白沿隐窝轴的表达梯度;(E)展示 CA1 在不同条件下的空间分布;(F-G)呈现三组样本细胞的 UMAP 聚类及分化标志物的表达强度，解析单细胞水平的分化轨迹。

图 5：WNR 信号对类器官成熟的调控

(A)展示不同培养条件(+WNR、−WNR、−WNR+BMP)下类器官的 PCA 聚类;(B)呈现 + WNR 与−WNR 组类器官的差异蛋白火山图;(C-D)展示干细胞标志物、增殖标志物、分化标志物在不同条件下的表达变化;(E)展示氧化磷酸化通路的富集分析结果;(F-G)展示 MUC17 在不同条件下的免疫荧光成像及表达定量，验证 WNR 信号对类器官成熟的调控作用。

全文总结

本研究由多国团队合作开展，在《Cell Systems》(2025)发表成果，核心是优化深度视觉蛋白质组学(DVP)技术，建立人结肠空间蛋白质组资源，并用于验证结肠类器官的表型特征。通过 DVP 与单细胞 DVP(scDVP)，实现人结肠组织、体外类器官、原位移植类器官的蛋白质组对比，同时探索 WNR 信号通路对类器官成熟的调控。研究不仅提供了高分辨率的人结肠蛋白质组数据，还验证了原位移植类器官的体内样表型，为肠道疾病的类器官模型优化与再生治疗提供技术支撑。局限性在于未涵盖更多疾病模型，且长期移植后的免疫排斥问题未深入探讨，未来需结合临床样本与动物模型进一步拓展研究范围。