NanoLuc-GFP 双报告系统解锁基因表达定量新方式

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A cost-effective dual reporter system in Nicotiana benthamiana

中文标题：本氏烟草中一种高性价比的双报告基因系统

发表期刊：《Frontiers in Plant Science》

影响因子：4.8

作者单位：

1.Basic Forestry and Plant Proteomics Research Center, Haixia Institute of Science and Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, China;

2.Syngenta Biotechnology China, Beijing, China

作者信息：

Zeru Zhang, Shuangle Yan, Fuqi Li, Gaoping Qu(通讯作者)

研究背景

双报告基因检测法被广泛用于各类模式系统的基因表达定量分析，但该方法目前依赖商业试剂盒，对低预算实验室和高通量筛选研究造成了限制;传统的 FLuc/RLuc 双报告系统是应用最广泛的体系，却因 FLuc 检测需要 ATP、Mg²+ 等辅因子，反应产物会抑制其活性且自身稳定性差，导致检测过程复杂且高度依赖试剂盒，而近年来虽发现了 GLuc、NanoLuc、iLuc 等新型荧光素酶和 GFP、mCherry 等荧光蛋白可作为报告基因，也有部分新型双报告系统被报道，但缺乏对各类报告基因的系统性同步比较，尚未开发出适用于本氏烟草的无试剂盒、精准且低成本的双报告基因系统，因此本研究通过系统性表征七种常用或潜在的报告基因，旨在筛选出最优组合，构建适用于本氏烟草的高性价比双报告基因系统。

研究方法

本研究以本氏烟草为实验材料，在 25℃、16h 光照 / 8h 黑暗的长日照条件下培养，选取成熟叶片用于农杆菌浸润实验;以 pCambia1300 为骨架构建高表达载体 pHEQ22，通过无缝克隆技术将四种荧光素酶(RLuc、GLuc、iLuc、NanoLuc)和三种荧光蛋白(GFP、ZsGreen、TagRFP-T)分别构建至该载体，同时构建含 FLuc/RLuc 系统和 GAL4 UAS 调控元件的对照载体;将重组质粒转化农杆菌 C58C1，调至合适 OD₆₀₀并加入乙酰丁香酮诱导后，浸润本氏烟草叶片，3 天后收集等量叶片样品，采用特定提取缓冲液提取总蛋白;利用酶标仪检测不同荧光素酶的相对荧光单位(RLU)，分别使用腔肠素、二苯并嗪、呋喃甲嗪为底物，优化底物浓度并测定酶活动力学，检测不同荧光蛋白的相对荧光单位(RFU)并优化检测参数;参照 Promega E1910 试剂盒说明书检测传统 FLuc/RLuc 系统的活性，通过公式计算各报告基因的信号半衰期，构建标准曲线分析其线性范围;进一步验证筛选出的 NanoLuc-GFP 双报告系统的稳定性，分别检测不同植株个体、不同单色光环境下该系统的报告基因表达比值，并将其与传统 FLuc/RLuc 系统在转录激活 / 抑制实验中进行灵敏度、成本的对比分析，所有实验均设置三次重复，采用统计学方法分析数据。

实验结果

图 1：不同底物浓度下荧光素酶的酶活动力学和信号半衰期

该图展示了 RLuc、GLuc、iLuc、NanoLuc 四种荧光素酶在不同底物浓度下的 RLU 时间变化曲线及相对 RLU 变化和信号半衰期。结果显示，四种荧光素酶的 RLU 均随底物浓度升高而增加，且未出现饱和现象;RLuc 和 GLuc 的信号稳定性随底物浓度升高而降低，信号半衰期随腔肠素浓度升高显著缩短，如 RLuc 在 28mM、56mM、139mM CTZ 下半衰期分别为 12min、10min、6min，GLuc 则为 38min、31min、16min，推测是受反应产物腔肠酰胺的抑制;而 iLuc(以 DTZ 为底物)和 NanoLuc(以呋喃甲嗪为底物)的信号半衰期在测试的底物浓度范围内几乎保持稳定，其中 NanoLuc 的信号半衰期最长，在 28mM、56mM、111mM 呋喃甲嗪下分别达 130min、124min、94min，表明不同荧光素酶受底物浓度的影响存在显著差异，RLuc 和 GLuc 需控制底物浓度，而 iLuc 和 NanoLuc 对底物浓度的耐受性更强。

图 2：不同酶浓度下荧光素酶的酶活动力学及标准曲线

该图呈现了四种荧光素酶在最优底物浓度下，不同酶浓度梯度的 RLU 时间变化曲线及基于 0 秒 RLU 值构建的标准曲线。结果表明，RLuc 和 NanoLuc 的 RLU 随酶浓度升高呈比例增加，而 GLuc 和 iLuc 仅在酶浓度低于 60% 时 RLU 上升，60%-100% 浓度范围内 RLU 几乎无差异，且高酶浓度下酶活衰减更显著;所有测试荧光素酶的信号半衰期均随酶浓度升高而缩短，RLuc 在低浓度下半衰期也最短，NanoLuc 则在所有检测浓度下均保持极高稳定性，半衰期为 86-304min，是其他三种的近 10 倍;标准曲线分析显示，RLuc 和 NanoLuc 在检测的酶浓度范围内均表现出良好的线性关系，而 GLuc 和 iLuc 仅在低浓度下线性，高浓度下线性消失，易导致蛋白定量误差，因此 GLuc 和 iLuc 检测需使用较低的酶浓度。

图 3：线性报告基因 RLuc 和 NanoLuc 在不同反应时间的标准曲线

该图对比了 RLuc 和 NanoLuc 在 0-10 分钟不同反应时间点的标准曲线及 R² 值变化。结果显示，RLuc 标准曲线的斜率随反应时间延长逐渐降低，且前两分钟下降最为明显，R² 值也随时间小幅降低，说明其检测结果受反应时间影响显著，需严格控制检测时间节点，增加了实验操作的复杂性;而 NanoLuc 的标准曲线斜率在测试的 10 分钟内几乎保持恒定，R² 值始终接近 0.998，无明显波动，表明其酶活信号稳定性远优于 RLuc，是更理想的报告基因选择。

图 4：荧光蛋白的线性关系分析

该图展示了 GFP、ZsGreen、TagRFP-T 三种荧光蛋白经系列稀释后的 RFU 标准曲线。结果表明，GFP 在整个检测的浓度范围内表现出极佳的线性关系，R² 值达 0.9985，其绝对浓度在 100% 相对浓度时为 1125nM，且信号背景比约 2000，与测试的荧光素酶相当;而 ZsGreen(四聚体荧光蛋白)和 TagRFP-T(单体红色荧光蛋白)仅在低浓度下表现出线性，高浓度下线性消失，推测 ZsGreen 的非线性源于其寡聚化特性，TagRFP-T 则是因高浓度下不同异构体的平衡状态被打破，且本氏烟草材料的自发荧光对三种荧光蛋白的检测影响极小，证实 GFP 是适用于蛋白定量的最优荧光蛋白报告基因。

图 5：无试剂盒双报告基因系统的表征及与 FLuc/RLuc 系统的对比

该图分为五个部分，系统验证了 NanoLuc-GFP 双报告系统的稳定性并与传统 FLuc/RLuc 系统比较。A 和 B 部分显示，17 株本氏烟草中 GFP 和 NanoLuc 的单独表达量存在显著个体差异，差异倍数分别达 8.6 和 7.5，但 GFP/NanoLuc 的比值保持高度一致，最大偏差小于 69%，标准误差仅 0.04，说明该系统能有效降低生物个体差异的干扰;C 和 D 部分表明，不同单色光环境(白光、黑暗、蓝光、红光、远红光)对 GFP 和 NanoLuc 的表达量影响显著，黑暗和远红光下蛋白水平显著降低，但 GFP/NanoLuc 的比值波动极小，可见光下差异小于 10%，黑暗与白光间差异也小于 30%，证实该系统能有效减少剧烈环境波动的干扰;E 部分显示，在转录激活 / 抑制实验中，NanoLuc-GFP 系统对转录激活因子 VP16 的响应达 8.3 倍，远高于 FLuc/RLuc 系统的 4.9 倍，对转录抑制因子 SRDX 的抑制效果与传统系统相当，且标准误差更小，表明 NanoLuc-GFP 系统的灵敏度显著优于传统 FLuc/RLuc 系统。

研究结论

本研究针对传统双报告基因系统依赖商业试剂盒、成本高的问题，以本氏烟草为实验材料，系统性表征了四种荧光素酶和三种荧光蛋白共七种报告基因的底物浓度效应、酶浓度效应、信号半衰期和线性范围，发现底物浓度对 RLuc、GLuc 的信号稳定性影响显著，而 NanoLuc 和 iLuc 受其影响较小，所有荧光素酶的信号半衰期均随酶浓度升高而缩短，其中 NanoLuc 在各浓度下均保持最长的信号半衰期和良好的线性，荧光蛋白中仅 GFP 在全检测浓度范围内表现出优异的线性且背景干扰小;基于此筛选出 NanoLuc-GFP 为最优报告基因组合，构建了无试剂盒的双报告基因系统，该系统能有效降低生物个体差异和剧烈环境波动对实验结果的干扰，且与传统的 FLuc/RLuc 系统相比，不仅成本仅为后者的 6% 左右，还具有更高的检测灵敏度，同时本研究还明确了报告基因检测的关键要点，即需优化底物 / 检测参数、构建标准曲线并选择合适的酶浓度，该高性价比的 NanoLuc-GFP 双报告基因系统不仅适用于本氏烟草，还可拓展至大肠杆菌、酵母、哺乳动物 HEK293T 细胞等其他系统，为低预算实验室和高通量筛选研究提供了理想的基因表达定量工具，也为报告基因的选择和应用提供了系统性的实验依据。