miR-885-3p 靶向 BMPR1A：结肠癌抗血管生成治疗新机制！

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：MicroRNA-885-3p inhibits the growth of HT-29 colon cancer cell xenografts by disrupting angiogenesis via targeting BMPR1A and blocking BMP/Smad/Id1 signaling

中文标题：微小 RNA-885-3p 通过靶向骨形态发生蛋白受体 1A 并阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路破坏血管生成，抑制 HT-29 结肠癌细胞异种移植物生长

发表期刊：《Oncogene》

影响因子：7.3

作者单位：

Glycochemistry and Glycobiology Laboratory, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China

作者信息：

F Xiao, H Qiu, H Cui, X Ni, J Li, W Liao, L Lu and K Ding

研究背景

微小 RNA(miRNAs)可在转录后水平沉默基因表达，参与肿瘤进展包括血管生成过程，血管生成是肿瘤发生发展的关键环节，DNA 结合蛋白抑制剂 Id1 作为促血管生成因子是公认的抗血管生成靶点;骨形态发生蛋白(BMPs)通过 BMPR1A 等受体激活 BMP/Smad 信号通路调控 Id1 表达，阻断该通路或为抑制 Id1 的理想策略，但 miRNAs 是否通过调控 BMPs 或其受体影响肿瘤生长和血管生成仍不明确。miRNAs 在结肠癌等肿瘤发展中发挥关键作用，然而 miR-885-3p 在结肠癌中的作用及作用机制尚未阐明，此前研究发现 miR-885-3p 受结合 BMPR1A 的硫酸化多糖调控并抑制血管生成，本研究旨在探究 miR-885-3p 在结肠癌血管生成中的具体作用及通过调控 BMPR1A 和 BMP/Smad/Id1 信号通路发挥作用的分子机制。

研究方法

本研究首先在人微血管内皮细胞 HMEC-1 和人脐静脉内皮细胞 HUVEC 中过表达或沉默 miR-885-3p，通过管形成、划痕愈合和 Transwell 实验检测其对体外血管生成的影响;利用慢病毒感染系统在 HMEC-1 中过表达 miR-885-3p，结合基质胶栓实验通过 CD31 免疫染色检测其体内血管生成作用。借助 miRNA 靶标预测软件筛选靶点，构建 BMPR1A 3'UTR 野生型和突变型荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告实验验证 miR-885-3p 与 BMPR1A 的直接靶向关系;采用 RT-PCR、Western blot 检测 miR-885-3p 对 BMPR1A 及 BMP/Smad/Id1 信号通路相关分子(Smad1/5/8、Id1)表达和磷酸化的影响。通过 shRNA 敲低、过表达质粒转染 BMPR1A，结合血管生成相关功能实验验证其作用，并开展回补实验明确 miR-885-3p 通过靶向 BMPR1A 发挥作用。检测多种肿瘤细胞系中 miR-885-3p 和 BMPR1A 的表达相关性，重点在 HT-29 结肠癌细胞中验证 miR-885-3p 对 BMP/Smad/Id1 信号通路的调控。构建稳定过表达 miR-885-3p 的 HT-29 细胞系，建立裸鼠异种移植瘤模型，检测肿瘤生长情况;收集结肠癌临床配对标本，检测 miR-885-3p 和 BMPR1A 的表达水平。通过免疫组化检测移植瘤组织中 CD31、BMPR1A 表达，结合 RT-PCR、Western blot 验证移植瘤中 miR-885-3p 对 BMP/Smad/Id1 信号通路和血管生成的调控;同时检测 miR-885-3p 对 VEGFA、TGFβ1 等其他促血管生成因子的影响，通过中和抗体、外源性蛋白回补实验比较其与 BMPR1A 介导的抗血管生成作用强度。实验采用 MTT 法检测细胞活力，利用 Image Pro Plus 进行免疫组化图像定量分析，统计学分析采用 Student’s t 检验和单因素方差分析，p<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图1：miR-885-3p 在体外抑制血管生成

该图通过 qPCR 验证 HMEC-1 细胞中转染 miR-885-3p 模拟物可显著过表达 miR-885-3p，转染抑制剂则显著沉默其表达;管形成实验显示 miR-885-3p 过表达可显著减少 HMEC-1 细胞的管结构长度，而沉默 miR-885-3p 则促进管形成;划痕愈合实验表明 miR-885-3p 过表达显著抑制 HMEC-1 细胞的迁移能力，沉默后则促进细胞迁移，在 HUVEC 细胞中也得到一致的体外血管生成抑制结果，证实 miR-885-3p 可在体外直接抑制内皮细胞的血管生成相关功能。

图2：miR-885-3p 在体内抑制血管生成

该图先验证慢病毒感染可有效在 HMEC-1 细胞中过表达 miR-885-3p;基质胶栓实验结合 CD31 免疫染色显示，含 miR-885-3p 过表达 HMEC-1 细胞的基质胶栓中 CD31 阳性血管数量显著少于对照组，光学密度定量分析也证实 CD31 表达水平显著降低，结合体外实验结果，明确 miR-885-3p 在体内外均具有抑制血管生成的作用。

图3：miR-885-3p 直接靶向 BMPR1A 3'UTR 并在 HMEC-1 细胞中阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路

该图通过序列比对发现 miR-885-3p 与 BMPR1A 3'UTR 存在部分互补结合位点;双荧光素酶报告实验显示，miR-885-3p 可显著抑制野生型 BMPR1A 3'UTR 报告载体的荧光素酶活性，对突变型则无影响，且 miR-885-3p 抑制剂可剂量依赖性促进野生型载体活性，证实 miR-885-3p 直接靶向结合 BMPR1A 3'UTR。RT-PCR 和 Western blot 结果显示，miR-885-3p 过表达可显著降低 HMEC-1 细胞中 BMPR1A 的 mRNA 和蛋白表达，同时抑制 Smad1/5/8 磷酸化和 Id1 表达;而沉默 miR-885-3p 则得到相反结果，在 HUVEC 细胞中也验证了该调控作用，明确 miR-885-3p 通过靶向 BMPR1A 阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路。

图4：BMPR1A 促进 HMEC-1 细胞的血管生成和 BMP/Smad/Id1 信号通路激活

该图显示 shRNA 敲低 BMPR1A 可显著降低 HMEC-1 细胞中 BMPR1A、Id1 表达及 Smad1/5/8 磷酸化，同时抑制细胞管形成和迁移;过表达 BMPR1A 则显著增强 BMP/Smad/Id1 信号通路激活，并促进内皮细胞管形成和迁移。回补实验表明，在 miR-885-3p 过表达的 HMEC-1 细胞中重新表达 BMPR1A，可显著恢复细胞的管形成和迁移能力，证实 miR-885-3p 对血管生成的抑制作用至少部分通过靶向 BMPR1A 介导。

图5：miR-885-3p 与 BMPR1A 表达呈负相关，且在 HT-29 结肠癌细胞中抑制 BMPR1A 表达和 BMP/Smad/Id1 信号通路

该图通过检测多种肿瘤细胞系发现，在包括 HT-29 在内的多数肿瘤细胞中 miR-885-3p 表达水平与 BMPR1A 呈显著负相关，结肠癌细中 miR-885-3p 低表达、BMPR1A 高表达。qPCR 验证 HT-29 细胞中转染 miR-885-3p 可实现过表达，转染抑制剂则沉默其表达;RT-PCR 和 Western blot 结果显示，miR-885-3p 过表达可显著降低 HT-29 细胞中 BMPR1A、Id1 表达及 Smad1/5/8 磷酸化，沉默 miR-885-3p 则促进该信号通路激活，在 HCT 116 结肠癌细胞中也得到一致结果，证实 miR-885-3p 在结肠癌细胞中同样调控 BMPR1A 和 BMP/Smad/Id1 信号通路。

图6：miR-885-3p 抑制裸鼠中 HT-29 结肠癌异种移植物生长，且结肠癌临床标本中 miR-885-3p 低表达、BMPR1A 高表达

该图验证慢病毒感染可有效在 HT-29 细胞中过表达 miR-885-3p;裸鼠异种移植瘤实验显示，过表达 miR-885-3p 的 HT-29 细胞形成的肿瘤体积和重量显著小于对照组，小鼠体重无明显变化，miR-885-3p 的治疗效应约为 48%。qPCR 检测 8 例结肠癌临床配对标本发现，肿瘤组织中 miR-885-3p 表达显著低于癌旁组织，BMPR1A 表达则显著升高;免疫组化结果也证实肿瘤组织中 BMPR1A 的表达水平和光学密度显著高于癌旁组织，明确临床标本中 miR-885-3p 与 BMPR1A 表达呈负相关。

图7：miR-885-3p 在 HT-29 异种移植物中抑制血管生成并阻断BMP/Smad/Id1 信号通路

该图通过免疫组化检测发现，过表达 miR-885-3p 的移植瘤组织中 CD31 阳性血管数量和 BMPR1A 表达水平均显著低于对照组，光学密度定量分析验证了该差异。qPCR 结果显示，移植瘤组织中 miR-885-3p 表达显著升高，BMPR1A mRNA 表达显著降低;Western blot 结果证实，过表达 miR-885-3p 可显著降低移植瘤中 BMPR1A、Id1 蛋白表达及 Smad1/5/8 磷酸化，证实 miR-885-3p 在体内通过下调 BMPR1A、阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路抑制结肠癌移植瘤的血管生成，进而抑制肿瘤生长。

图8：miR-885-3p 通过阻滞 BMPR1A 和 BMP/Smad/Id1 信号通路介导的抗血管生成作用强于通过 VEGFA、TGFβ1 等细胞因子的作用

该图 Western blot 结果显示，miR-885-3p 过表达可降低 HT-29 细胞中 VEGFA、TGFβ1 表达，对 FGF9 无明显影响。条件培养基实验显示，miR-885-3p 过表达的 HT-29 细胞培养基可显著抑制 HMEC-1 细胞管形成，加入 VEGFA 或 TGFβ1 中和抗体后抑制作用增强，加入外源性 VEGFA 或 TGFβ1 则可部分恢复管形成;而在 miR-885-3p 过表达的 HMEC-1 细胞中加入外源性 VEGFA 或 TGFβ1，对管形成的恢复作用显著弱于回补 BMPR1A 的效果，证实 miR-885-3p 虽可调控 VEGFA、TGFβ1 等细胞因子，但通过靶向 BMPR1A 阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路是其发挥抗血管生成作用的主要途径。

研究结论

本研究首次阐明 miR-885-3p 在结肠癌血管生成和肿瘤生长中的作用及分子机制，证实 miR-885-3p 可在体内外直接抑制内皮细胞的血管生成相关功能，其通过直接靶向结合 BMPR1A 的 3'UTR，下调 BMPR1A 表达，进而阻断 BMP/Smad/Id1 信号通路的激活，抑制促血管生成因子 Id1 的表达，这是其发挥抗血管生成作用的核心机制;BMPR1A 作为促血管生成因子，其敲低可抑制血管生成，回补 BMPR1A 可逆转 miR-885-3p 的抗血管生成效应。在多种肿瘤细胞系及结肠癌临床标本中，miR-885-3p 与 BMPR1A 的表达呈显著负相关，结肠癌中 miR-885-3p 低表达、BMPR1A 高表达;过表达 miR-885-3p 可显著抑制裸鼠中 HT-29 结肠癌异种移植物的生长，该效应依赖于其对肿瘤血管生成的抑制，且对小鼠无明显毒性。此外，miR-885-3p 虽可调控 VEGFA、TGFβ1 等其他促血管生成因子的表达，但其通过阻滞 BMPR1A 和 BMP/Smad/Id1 信号通路介导的抗血管生成作用更为显著，同时 BMPR1A 可通过上调 VEGFA 促进肿瘤血管生成，揭示了肿瘤细胞与内皮细胞间的交叉调控机制。本研究证实 miR-885-3p 是结肠癌中重要的抑癌性 miRNA，为结肠癌的抗血管生成治疗提供了新的靶点，也为 miRNA 靶向治疗肿瘤提供了新的实验证据和理论依据。