猪与啮齿类（小鼠 / 大鼠）支持细胞（SCs）分离、培养及肾被膜下移植的标准化实验方案

本文献由美国德州理工大学健康科学中心的团队发表于《Methods in Molecular Biology》，是首个覆盖跨物种(新生猪、小鼠、大鼠)支持细胞(Sertoli Cells, SCs)“分离 - 培养 - 移植 - 鉴定” 全流程的标准化方案。其核心价值在于：针对 SCs 在生殖生物学(生精机制研究)、临床前治疗(1 型糖尿病胰岛移植保护、帕金森病神经元移植支持)及毒性测试中的应用需求，统一了不同物种 SCs 的分离参数(消化酶浓度、孵育时间)，优化了 SCs 培养模式(聚集态用于移植、单层用于基础研究)，并细化了肾被膜下移植的手术操作与术后鉴定步骤，解决了传统方法中 “物种流程混乱、酶解条件难控、移植成功率低” 的痛点，为 SCs 相关研究提供可直接复用的技术框架。

研究背景

支持细胞(SCs)是睾丸生精小管内的关键体细胞，兼具生精支持与免疫调节双重核心功能：一方面，SCs 通过构建血睾屏障(BTB)、分泌视黄酸、抑制素等因子，调控生殖细胞(germ cell)的发育与迁移，是精子发生的 “结构与功能支架”;另一方面，SCs 可分泌 TGF-β、半乳糖凝集素 - 1、吲哚胺 2,3 - 双加氧酶(IDO)等免疫调节分子，建立免疫耐受微环境，避免生殖细胞(具有免疫原性)引发炎症反应。

基于这些特性，SCs 已成为男性生育研究、男性避孕靶点筛选及细胞治疗的重要工具 —— 例如，通过 SCs 的免疫保护作用可提升胰岛移植(治疗 1 型糖尿病)、多巴胺能神经元移植(治疗帕金森病)的存活率。但现有技术长期面临三大瓶颈：一是物种特异性流程混乱，猪(大动物，临床前移植模型)与啮齿类(小鼠 / 大鼠，基础研究模型)的 SCs 分离无统一标准，消化酶浓度、孵育时间差异大;二是酶解条件难优化，SCs 与间质细胞、生殖细胞紧密连接，过度消化会导致 SCs 活力下降，消化不足则细胞纯度低(<70%);三是移植操作门槛高，SCs 移植需精准控制细胞状态(聚集态 vs 单层)与注射量，传统方法移植成功率不足 60%，且缺乏术后标准化鉴定手段。

此前虽有啮齿类 SCs 分离报道，但未涵盖猪等大动物，且未整合 “分离 - 培养 - 移植 - 鉴定” 全流程，导致研究结果难以重复。因此，本研究建立跨物种的标准化方案，填补这一技术空白。

实验方法

(1)新生猪 SCs 分离

将收集的新生猪睾丸用 70% 乙醇洗涤 2 次(每次倒置 12 次)，再用冷 HBSS 洗涤 1 次并冰上保存;在无菌超净台内，用无菌剪刀和镊子剥离睾丸白膜与附睾，避免 puncturing 睾丸实质，随后将睾丸组织剪为 0.5-1mm³ 小块，每 50mL 离心管分装 8-10 个睾丸的组织块。

加入 25mL 过滤灭菌的 1mg/mL 胶原酶溶液，拧紧管盖并包裹 parafilm，置于 37℃摇水浴(90rpm)消化 10min，期间 6min 时取样观察生精小管与间质组织的分离情况;消化完成后，用 HBSS 将悬液体积补至 50mL 以终止反应，308G 离心 2min，重复洗涤 3 次;去除上清后加入 40mL 解离培养基，再加入 1mL 胰酶与 2mL DNase I，继续摇水浴消化 10min 至获得单细胞悬液。

最后用 500μm 无菌滤网过滤单细胞悬液，HBSS 洗涤 3 次后计数，根据实验需求选择培养模式：若为移植准备，将 SCs 接种于 150×15mm 无菌非组织培养皿，用 Ham’s F10+10% FCS 培养 48h 以形成聚集态;若用于基础研究，接种于 100×10mm 组织培养皿，用 DMEM+10% FCS 培养形成单层。

(2)小鼠 / 大鼠 SCs 分离

麻醉小鼠或大鼠后，对腹部进行消毒并做纵向切口(从盆腔至胸骨)，借助附睾脂肪提取睾丸，剥离附睾后将睾丸放入含 25mL 冷 HBSS 的离心管，20 个小鼠睾丸或对应数量大鼠睾丸为一管。

组织处理与猪 SCs 类似，剪为 0.5-1mm³ 小块后，加入 25mL 1mg/mL 胶原酶溶液，37℃摇水浴消化 7min(4min 时取样观察);后续洗涤、胰酶 + DNase I 消化(10min)、过滤与培养步骤同猪 SCs，但需注意大鼠 SCs 分离前需先去除睾丸白膜，且培养时聚集态与单层的培养基选择一致。

SCs 肾被膜下移植流程

移植前 1 天，收集培养 48h 的聚集态 SCs，用细胞刮轻轻剥离皿底细胞，860G 离心 2min，用无 FCS 的 Ham’s F10 重悬;通过 DNA assay 计数细胞，按 “小鼠受体 400 万 SCs / 只、大鼠受体 1100 万 SCs / 只” 分装至 1.5mL 离心管，开盖置于培养箱中让细胞自然沉降。

移植手术时，用异氟烷麻醉受体小鼠，通过脚趾捏合实验验证麻醉效果，眼部涂抹抗生素眼膏保护;左侧腹部用碘附 scrub 与碘附溶液交替消毒 3 次，做小切口暴露左肾，用无菌棉签(蘸无菌生理盐水)轻轻拉出肾脏;用 27G 针头在肾前背侧划小口，硅化玻璃探针在肾被膜下构建囊袋，将装有 SCs pellet 的 PE-50 管(提前用 70% 乙醇与无 FCS Ham’s F10 清洗)插入囊袋，注入细胞后电凝封口。

术后将肾脏放回腹腔，用 5-0 DEXON 缝线缝合肌层，皮肤用缝合钉闭合，给小鼠注射丁丙诺啡(0.01-0.05mg/kg，24h 内注射 2 次)镇痛，待小鼠完全苏醒后放回饲养笼;移植后 1-8 天收集移植物，通过 WT1 免疫组化(SCs 特异性标志物)验证 SCs 存活。

关键结果

图1：新生猪睾丸处理与切碎

该图展示新生猪睾丸从收集到切碎的关键步骤：A 图为剥离睾丸白膜的操作，B 图为去除白膜后的睾丸实质，C 图为在冷 HBSS 中用无菌钝剪切碎组织，D 图为切碎后 0.5-1mm³ 的组织块。结果表明，规范的组织预处理(去除白膜、控制切碎尺寸)可减少后续酶解杂质，为 SCs 高纯度分离奠定基础。

图2-3：酶解过程的细胞形态验证

图2 展示胶原酶与胰酶消化的时间依赖性效果：A 为胶原酶孵育 6min 的生精小管(未完全分离)，B 为 10min 后小管分散，C 为胰酶孵育 10min 的单细胞;图3 进一步放大显示：A 为消化前生精小管团聚，B 为胶原酶 5min 后小管松散，C 为胰酶 10min 后单细胞(20× 镜下)。结果明确酶解时间节点 —— 猪 SCs 需胶原酶 10min + 胰酶 10min，啮齿类 SCs 胶原酶 7min，确保 SCs 解离为单细胞且活力 > 85%。

图4：SCs 过滤纯化

该图为 500μm 滤网过滤流程：A 为用无菌镊子安装滤网，B 为闭合过滤器，C 为过滤单细胞悬液(DNA 团聚体被截留)。结果证实过滤可有效去除未消化组织与 DNA 团聚体，提升 SCs 纯度至 > 90%。

图5：啮齿类(小鼠 / 大鼠)睾丸收集

该图为小鼠睾丸收集步骤：A 为麻醉小鼠腹部纵向切口，B 为睾丸放入冷 HBSS 离心管，C 为睾丸剪为 1mm³ 小块。结果表明，通过腹部切口提取睾丸可减少组织损伤，20 个小鼠睾丸 / 管的分离效率最高。

图6：SCs 培养形态

该图对比不同物种 SCs 的培养模式：A 为小鼠 SCs 聚集态(移植用)，B 为新生猪 SCs(NPSCs)聚集态，C 为小鼠 SCs 聚集态的 H&E 染色(显示细胞紧密连接)，D 为 NPSCs 单层培养(梭形形态)。结果证实，非组织培养皿可诱导 SCs 形成聚集态(利于移植存活)，组织培养皿则形成单层(便于基础实验观察)。

图7-8：移植前 SCs 浓缩

图7 为 1.5mL 离心管中 SCs 聚集沉降(开盖置于培养箱)，图8 为 PE-50 管处理：A 为用显微操作仪将 SCs pellet 吸入管内，B 为离心管放入 spinner，C 为离心后管内形成致密 pellet。结果表明，该浓缩方法可使 SCs 密度达 “400 万 / 小鼠受体” 的移植需求，且细胞活力无显著下降。

图9-12：肾被膜下移植与鉴定

图9 为移植手术步骤：A 为拉出左肾，B 为硅化玻璃探针构建囊袋，C 为插入 PE-50 管，D 为注入细胞，E 为电凝封口，F 为缝合肌层，G 为闭合皮肤;图10 为硅化玻璃探针特写，图11 为移植操作台布局，图12 为移植后鉴定：A 为 1 天后肾被膜下 NPSCs 移植物，B 为 8 天后小鼠 SCs 移植物的 WT1 染色(棕色为阳性，证实存活)。结果显示，该手术流程的移植成功率达 > 80%，WT1 染色可有效验证 SCs 存活。

全文总结

本研究建立的跨物种 SCs 标准化方案，以 “流程统一化、操作可重复、结果可靠” 为核心优势：在分离环节，明确不同物种的酶解参数(猪胶原酶 10min、啮齿类 7min)，通过 500μm 过滤提升纯度至 > 90%;在培养环节，区分聚集态(移植用)与单层(基础研究用)，适配不同实验需求;在移植环节，细化肾被膜下手术步骤，结合 WT1 免疫组化鉴定，使移植成功率提升至 > 80%。

该方案不仅适用于生殖生物学(生精机制、男性避孕)研究，还为 SCs 在细胞治疗(糖尿病、神经退行性疾病)中的临床前应用提供技术支撑。局限在于未涵盖成年动物 SCs 分离(需额外优化胶原酶类型与浓度)，未来可结合成年小鼠 / 人 SCs 分离方法(如 0.1% 胶原酶 IV 消化)进一步拓展方案通用性。