利用组织研磨仪机械分离猪脐带细胞（UCCs）的方法建立

研究背景

UC-MSCs 因获取无创、无伦理争议，是生物医学(如细胞治疗、药物筛选)与农业(如培养肉)的理想细胞来源，但传统分离方法存在局限：一是酶消化法(胶原酶、胰酶)成本高，动物源酶易导致细胞污染，且过度消化会降低细胞活力与分化能力;二是组织块培养法耗时(需 2 周以上)，细胞产量低且易偏向高迁移性亚群，标准化难度大。此外，猪作为与人类生理更接近的模型动物，其脐带 MSC 分离方案长期依赖上述传统方法，缺乏高效、经济的机械分离方案。因此，团队首次采用TIGR 组织研磨仪(机械解离)优化猪 UCCs 分离流程，解决传统方法的核心问题。

来自德国农场动物生物学研究所(FBN)的团队发表在《Cells》上题为《Isolation of Porcine Umbilical Cord Cells by Mechanical Tissue Dissociation Using a Tissue Grinder》的研究，聚焦猪脐带间充质基质细胞(UC-MSCs)分离的技术痛点。

摘要

本研究旨在建立猪脐带细胞(UCCs)的高效机械分离方案，为 MSC 相关研究提供可靠细胞模型。

方法：取新生德国长白猪脐带，去血管后用TIGR 组织研磨仪(预设 “medium” 程序)机械解离，测试 3 种组织 - 培养基比例(0.75:1、1:1、1.5:1)，培养至 P3，检测细胞活力、增殖率、代谢活性、集落形成能力、表面标志物(CD73/CD90/CD105)及三系分化潜能。

结果：1. 0.75:1 和 1:1 比例可获得高产量(23.6-27.2×10⁵ cells/g 组织)与活力(61.2%±17.9)，1.5:1 比例产量显著降低;2. 培养至 P3 时细胞活力超 90%，增殖率持续升高，呈典型梭形 MSC 形态;3. 细胞高表达 CD90(96.5%±2.4)与 CD105(75.3%±10.8)，可形成集落并完成脂肪(Oil Red O 阳性)、软骨(Alcian Blue 阳性)、成骨(Alizarin Red 阳性)三系分化。结论：TIGR 机械分离法无需酶解，快速且经济，可获得 MSC 样猪 UCCs，适用于细胞治疗、药物筛选及培养肉生产等领域。

实验方法

实验材料与 UCCs 分离培养：实验使用新生德国长白猪脐带(24 条，取样后 1-3h 内处理)，经 0.9% NaCl(含青霉素 / 链霉素 / 两性霉素 B)清洗，纵向切割去除血管，剪为≤0.25cm² 组织块;采用TIGR 组织研磨仪(带 100μm 滤网，程序：30s 切割 70rpm→30s 研磨 70rpm→25s 切割 50rpm→25s 切割 50rpm)机械解离，测试 3 种组织 - 培养基比例(0.75:1=375mg 组织 + 500μL 培养基、1:1=500mg+500μL、1.5:1=500mg+333μL);500×g 离心 10min 后，用含 20% FBS 的 αMEM 接种(P0)，24h 后换含 10% FBS 的生长培养基，37℃、5% CO₂培养，每周传代(P1-P3)，接种密度约 5000 cells/cm²。

细胞鉴定与功能检测：表面标志物检测：P0 收获后用流式细胞术(Gallios)检测 CD73(未标记抗体 + Alexa Fluor 647 二抗)、CD90(FITC 标记)、CD105(PE 标记);集落形成(CFU)实验：P1/P3 细胞以 200 cells / 孔接种，14 天后 4% 多聚甲醛固定，0.5% 结晶紫染色，计数≥50 细胞的集落;代谢活性(WST1)：P1/P3 细胞以 1600 cells / 孔接种，3/7 天后加入 WST1 试剂，检测 450nm 吸光度;三系分化：脂肪分化用含吲哚美辛、胰岛素的诱导培养基，11 天后 Oil Red O 染色;软骨分化用微团培养，14 天后 Alcian Blue 染色;成骨分化用含地塞米松、β- 甘油磷酸的培养基，14 天后 Alizarin Red 染色;所有数据用 SigmaPlot 13.0 分析，p≤0.05 为显著。

关键结果

图1：不同组织 - 培养基比例对分离细胞的影响

该图分析 3 种比例(0.75:1、1:1、1.5:1)的细胞特性：A 图为实验设计;B 图显示 3 组细胞活力无差异(均值 61.2%±17.9);C 图显示细胞大小无显著差异(均值 27.2μm±19.7);D 图显示0.75:1 比例产量最高(27.2×10⁵ cells/g 组织)，1.5:1 比例产量仅为其 45%(p≤0.05)。结果明确 0.75:1 和 1:1 为最优组织 - 培养基比例。

图2：UCCs 培养过程中的活力、大小与形态

该图追踪 P0-P3 的细胞状态：A 图显示各代细胞活力均超 90%，无组间差异;B 图显示细胞大小稳定(均值 18.6μm±2.1);C 图显示形态变化：P0 时细胞呈圆形 / 多边形，P1 后逐渐均一为梭形，P3 时部分细胞轻微伸长，无漂浮细胞(反映高活力)，且形态不受研磨比例影响。结果证实细胞在培养过程中稳定存活并逐步成熟。

图3：UCCs 的增殖能力评估

该图通过增殖率与结晶紫染色分析增殖：A 图显示0.75:1 和 1:1 比例的增殖率从 P0 到 P3 显著升高(p≤0.05)，1.5:1 比例各代增殖率无差异;B 图显示 P3 时 3 组细胞 7 天的结晶紫吸光度均显著高于 3 天(p≤0.05)，但组间无差异。结果表明 0.75:1 和 1:1 比例分离的细胞增殖能力更强，且培养后期增殖加速。

图4：UCCs 的代谢活性与集落形成能力

该图检测细胞功能：A 图(WST1)显示 1:1 和 1.5:1 比例的 P3 细胞代谢活性显著高于 P1(p≤0.05)，0.75:1 比例各代无差异;B 图(CFU)显示 3 组细胞均能形成集落，1.5:1 比例 P3 的集落数有下降趋势(p≤0.1)，但组间无显著差异。结果证实细胞代谢活跃且具备 MSC 核心特征 —— 集落形成能力。

图5：UCCs 的 MSC 样特征验证

该图确认细胞身份与分化潜能：A 图(流式)显示细胞高表达 CD90(96.5%±2.4)和 CD105(75.3%±10.8)，CD73 阳性率低(2.4%±0.6)，组间无差异;B 图(分化染色)显示 3 组细胞均能分化为脂肪细胞(Oil Red O 染色脂滴)、软骨细胞(Alcian Blue 染色蛋白多糖)、成骨细胞(Alizarin Red 染色钙沉积)。结果证实分离的 UCCs 具备 MSC 的核心特征 —— 表面标志物表达与三系分化能力。

全文总结

本研究建立了基于TIGR 组织研磨仪的猪脐带细胞(UCCs)机械分离方案：以 P3 新生猪脐带为原料，选择 0.75:1 或 1:1 的组织 - 培养基比例，无需酶解即可获得高产量(≥23.6×10⁵ cells/g 组织)、高活力(培养后超 90%)的细胞;这些细胞培养至 P3 仍保持增殖能力，高表达 MSC 表面标志物(CD90/CD105)，可形成集落并完成三系分化，确认为 MSC 样细胞。该方案解决了传统酶消化法(成本高、污染风险)与组织块培养法(耗时、产量低)的缺陷，具有快速、经济、可标准化的优势，为猪 MSC 相关研究(如髓鞘疾病模型、异种移植)及农业应用(培养肉生产)提供了可靠的细胞来源，同时为其他大型动物脐带细胞的分离提供了可借鉴的机械解离范式。