TNFAIP2 调控新机制揭晓：Rac1-ERK-AP1 轴驱动 HIF1α 转录促进 TNBC 血管生成

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：TNFAIP2 promotes HIF1α transcription and breast cancer angiogenesis by activating the Rac1-ERK-AP1 signaling axis

中文标题：TNFAIP2 通过激活 Rac1-ERK-AP1 信号轴促进 HIF1α 转录及乳腺癌血管生成

发表期刊：《Cell Death and Disease》

影响因子：9.6

作者单位：

1.School of Life Science, University of Science & Technology of China, Hefei, Anhui, China;

2.Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences and Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China;

3.Yunnan Key Laboratory of Breast Cancer Precision Medicine, Yunnan Cancer Hospital, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Peking University Cancer Hospital Yunnan, Kunming, China;

4.Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan, China;

5.Department of Pathology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan, China;

6.The School of Continuing Education, Kunming Medical University, Kunming, China;

7.Yunnan Key Laboratory of Breast Cancer Precision Medicine, Academy of Biomedical Engineering, Kunming Medical University, Kunming, China

作者信息：

Wenlong Ren, Huichun Liang, Jian Sun, Zhuo Cheng, Wenjing Liu, Yingying Wu, Yujie Shi, Zhongmei Zhou, Ceshi Chen(其中 Wenlong Ren 和 Huichun Liang 为共同第一作者)

研究背景

乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌(TNBC)亚型因远处转移发生率高、预后较差，约占所有乳腺癌病例的 20%。血管生成是实体肿瘤生长、侵袭和转移的关键步骤，由肿瘤微环境中的多种因子调控，其中肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子 A(VEGFA)通过旁分泌信号发挥重要作用，而缺氧诱导因子 - 1α(HIF1α)是实体瘤血管生成的核心驱动因子。HIF1α 在常氧下经羟基化和泛素 - 蛋白酶体途径快速降解，缺氧条件下主要通过翻译后修饰激活，也可在多种细胞因子和生长因子调控下发生转录水平改变。TNFAIP2 在多种肿瘤中高表达且与不良临床结局相关，此前研究表明其作为 KLF5 下游靶蛋白，可激活 Rho 小 GTP 酶家族成员 Rac1，促进 TNBC 细胞增殖、黏附、迁移、侵袭及 DNA 损伤药物耐药性，但 TNFAIP2 对肿瘤血管生成的潜在作用尚不明确。Rac1 已被证实可通过 VEGF 促进肿瘤血管生成、下调 p53 和 VHLα 上调 HIF1α 蛋白表达，且能激活 ERK1/2，而 ERK1/2 在 TNBC 中高表达并与不良预后相关，可调控转录因子 Fra1 和 c-Jun 的表达及 AP-1 异二聚体形成，还可能介导 LPS 诱导的 HIF1α 转录。因此，本研究旨在探究 TNFAIP2 是否通过调控 HIF1α 表达促进 TNBC 血管生成，并明确其潜在的分子信号通路。

研究方法

本研究采用细胞生物学、分子生物学、动物实验及临床样本分析等多种方法探究 TNFAIP2 在 TNBC 血管生成中的作用及机制。细胞层面，构建 TNFAIP2、Rac1/Rac1-P29S(组成型激活突变体)稳定过表达细胞系，以及 TNFAIP2、Fra1 稳定敲低细胞系，通过 siRNA 干扰 HIF1α、c-Jun、ERK2 等基因表达;采用 Western blot 检测蛋白表达，RT-qPCR 检测 mRNA 水平，ELISA 定量 VEGFA 分泌量;通过划痕愈合实验和管形成实验评估人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的迁移和血管生成能力;利用双荧光素酶报告实验检测 HIF1α 启动子活性，染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR、ChIP-qPCR 及 ChIP-seq 验证 AP-1 与 HIF1α 启动子的直接结合。动物实验方面，建立 HCC1806 细胞裸鼠原位移植瘤模型，随机分为对照组、U0126(ERK 抑制剂)组、Apatinib(VEGFR 抑制剂)组及联合用药组，或曲美替尼(临床批准 ERK 抑制剂)与 Apatinib 联合组，定期测量肿瘤体积和体重，实验结束后检测肿瘤组织中 CD31 表达以评估微血管密度。临床样本分析方面，构建包含 85 例 TNBC 组织和 95 例癌旁正常乳腺组织的组织芯片，通过免疫组化检测 TNFAIP2、p-ERK1/2 和 CD31 的表达并分析相关性。实验数据采用 GraphPad Prism 8.0 绘图，SPSS 23 进行统计分析，两组间比较采用双侧 t 检验，p<0.05 为差异有统计学意义，所有实验至少独立重复三次。

实验结果

图1：TNFAIP2 促进 TNBC 血管生成及 HIF1α 表达

该图显示，TNFAIP2 敲低的 HCC1806 细胞异种移植瘤中，CD31 免疫组化染色信号显著降低，表明微血管数量减少;缺氧条件下，HCC1806 和 MDA-MB-468 细胞的条件培养基可增强 HUVECs 的迁移和管形成能力，而 TNFAIP2 敲低可减弱该促血管生成效应。Western blot 和 RT-qPCR 结果显示，TNFAIP2 敲低显著抑制缺氧诱导的 HIF1α 蛋白和 mRNA 表达，同时降低其下游靶基因 GLUT-1 和 VEGFA 的 mRNA 水平，ELISA 验证 VEGFA 分泌量减少。TCGA 数据库分析显示，TNFAIP2 和 HIF1α 在 TNBC 组织中的表达显著高于非 TNBC 组织，GEO 数据库分析表明两者在乳腺癌组织中呈正相关，证实 TNFAIP2 与 HIF1α 表达及 TNBC 血管生成密切相关。

图2：TNFAIP2 通过上调 HIF1α 表达促进体外血管生成

该图显示，TNFAIP2 过表达可显著升高 HCC1806 细胞中 HIF1α、GLUT-1 和 VEGFA 的 mRNA 水平及 HIF1α 蛋白表达，增加 VEGFA 分泌量;而 HIF1α siRNA 干扰可逆转 TNFAIP2 过表达诱导的 VEGFA mRNA 上调。功能实验表明，TNFAIP2 过表达可促进 HUVECs 的迁移和管形成能力，且该效应可被 HIF1α 敲低完全阻断，证实 TNFAIP2 通过上调 HIF1α 表达介导 TNBC 的体外血管生成。

图3：TNFAIP2 通过 Rac1 促进 HIF1α 转录及体外血管生成

该图显示，Rac1 敲低可显著降低缺氧条件下 HCC1806 和 MDA-MB-468 细胞中 HIF1α、GLUT-1 和 VEGFA 的表达，减少 VEGFA 分泌，减弱 HUVECs 的迁移和管形成能力;过表达组成型激活突变体 Rac1-P29S 可增强缺氧诱导的 HIF1α 蛋白表达，且其诱导的 VEGFA 表达和血管生成效应可被 HIF1α 敲低逆转。在 TNFAIP2 过表达细胞中干扰 Rac1 表达，可阻断 TNFAIP2 诱导的 HIF1α 和 VEGFA 表达上调，以及 HUVECs 的迁移和管形成能力增强，证实 TNFAIP2 通过 Rac1 调控 HIF1α 表达进而促进血管生成。

图4：TNFAIP2 和 Rac1 通过 ERK 信号促进 HIF1α 转录及体外血管生成

该图显示，TNFAIP2 或 Rac1 敲低可降低 HCC1806 细胞中 p-ERK1/2 的水平;U0126 处理或 ERK2 siRNA 干扰可显著抑制缺氧诱导的 HIF1α、GLUT-1 和 VEGFA 表达，减弱 HUVECs 的迁移和管形成能力。在 TNFAIP2 过表达细胞中，U0126 处理或 ERK2 敲低可阻断 TNFAIP2 诱导的 HIF1α 和 VEGFA 表达上调，以及 HUVECs 的迁移和管形成能力增强;Rac1-P29S 过表达诱导的血管生成效应也可被 U0126 或 ERK2 siRNA 阻断，证实 TNFAIP2 和 Rac1 通过激活 ERK 信号通路调控 HIF1α 表达和血管生成。

图5：TNFAIP2 和 Rac1 通过 ERK 激活的 AP-1 促进 HIF1α 转录及体外血管生成

该图显示，TNFAIP2 敲低可降低 c-Jun 和 Fra1 的蛋白及 mRNA 水平，TNFAIP2 过表达则升高其表达;Rac1 或 ERK 抑制可下调 c-Jun 和 Fra1 表达。c-Jun 或 Fra1 敲低可显著抑制缺氧诱导的 HIF1α、GLUT-1 和 VEGFA 表达;双荧光素酶报告实验显示，c-Jun 和 Fra1 共过表达可显著激活 HIF1α 启动子活性;ChIP-seq、ChIP-PCR 及 ChIP-qPCR 证实 c-Jun 和 Fra1 可直接结合 HIF1α 启动子的特定区域。在 TNFAIP2 过表达细胞中敲低 Fra1，可阻断 TNFAIP2 诱导的 HIF1α 和 VEGFA 表达上调，以及 HUVECs 的迁移和管形成能力增强，证实 AP-1(c-Jun/Fra1)是 TNFAIP2-Rac1-ERK 通路下游调控 HIF1α 转录的关键转录因子。

图6：ERK 抑制剂与 VEGFR 抑制剂联合抑制 TNBC 体内肿瘤生长

该图显示，裸鼠原位移植瘤模型中，U0126 与 Apatinib 联合用药组的肿瘤体积和重量显著小于单独用药组，CD31 免疫组化显示微血管数量显著减少，且联合用药对小鼠体重无明显影响。曲美替尼与 Apatinib 联合组也获得类似结果，肿瘤体积和重量显著降低，小鼠体重无显著变化。组织芯片免疫组化分析显示，TNFAIP2 的表达水平与 p-ERK1/2 和 CD31 呈显著正相关，进一步验证了 TNFAIP2-Rac1-ERK-AP1-HIF1α 信号轴在 TNBC 血管生成中的作用。

研究结论

本研究明确了 TNFAIP2 在 TNBC 血管生成中的关键作用及分子机制，证实 TNFAIP2 通过激活 Rac1-ERK-AP1 信号轴促进 HIF1α 转录，进而上调 VEGFA 表达，最终增强肿瘤血管生成。具体而言，缺氧条件下 TNFAIP2 首先激活 Rac1，进而依次激活 ERK1/2 和 AP-1 转录因子(c-Jun/Fra1)，AP-1 直接结合 HIF1α 基因启动子并增强其转录活性，HIF1α 上调下游 VEGFA 等促血管生成因子表达，促进内皮细胞迁移和血管形成。动物实验表明，ERK 抑制剂(U0126 或曲美替尼)与 VEGFR 抑制剂 Apatinib 联合使用，可协同抑制 TNBC 肿瘤生长和血管生成，且对小鼠无明显毒性。临床样本分析显示，TNFAIP2 表达与 p-ERK1/2 和 CD31 表达呈正相关，进一步验证了该信号轴的临床相关性。本研究首次揭示了 TNFAIP2 调控 HIF1α 转录的分子通路，为 TNBC 提供了潜在治疗靶点，同时证实 ERK 抑制剂与 VEGFR 抑制剂联合治疗是 TNBC 的有效策略，为临床治疗提供了新的思路和实验依据。