烟草暴露下肺类器官与大鼠肺组织的稳定管家基因筛选 ——GAPDH 与 GAPDH+β-actin 为最优内参

肺类器官(LOs)作为体外 3D 模型，能模拟肺部微环境与生理功能，广泛用于烟草相关肺部疾病(如 COPD、肺癌)研究，但管家基因(内参基因)的稳定性尚未明确—— 传统内参(如 18s、β-actin)在烟草暴露等应激条件下可能表达波动，导致 RT-qPCR 定量结果偏差。本研究针对人类 / 小鼠肺类器官及大鼠肺组织，在生理状态、传统香烟与加热香烟暴露模型中，系统筛选稳定管家基因，为肺部疾病研究提供可靠内参，解决肺类器官应用中内参选择的关键问题。

来自中国烟草湖北工业有限责任公司的团队在《Experimental Lung Research》发表题为Screening and validation of stable housekeeping genes in lung organoids and rat lung models under tobacco exposure的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

肺类器官构建与处理：

从人 / 小鼠胚胎干细胞(ESCs)分步分化为肺类器官(ESC→定型内胚层 DE→前肠内胚层 AFE→肺芽尖祖细胞类器官 LPOs→气道类器官 AO)，用免疫荧光验证分化(ESC 标志物 OCT4、AO 标志物 P63/MUC5AC);

制备传统香烟 / 加热香烟烟雾冷凝物(CSE)，以 5 AU/mL 浓度处理类器官 15-30 分钟，后续培养 6 小时;大鼠肺组织直接暴露于两种烟草烟雾。

管家基因分析：

检测 5 个常见管家基因(GAPDH、β-actin、18s、RPS16、RPL19)的 CT 值，用 BestKeeper(SD/CV 值)、GeNorm(M 值)、NormFinder(稳定性评分)评估稳定性;

以肺部近端气道标志物 SOX2 为目标基因，验证单 / 组合内参的定量准确性。

(2)关键结果

单管家基因稳定性：在人 / 小鼠肺类器官及大鼠肺组织中，GAPDH 稳定性最高(SD<0.5，M 值 < 0.8)，受烟草暴露影响最小;18s 稳定性最差(SD>1.0，M 值 > 1.2)，其次为 RPL19。

组合管家基因：GAPDH+β-actin 为最优组合(综合评分最低)，用其定量 SOX2 时，烟草暴露导致的 SOX2 下调幅度更显著(较单内参高 20%-30%)，统计显著性更强(P<0.01 vs 单内参 P<0.05)。

跨模型一致性：加热香烟与传统香烟暴露下，管家基因稳定性排序一致，GAPDH 始终为最优单内参。

实验结果

图 1：肺类器官培养流程

该图展示类器官分化路径：(A)时间线：ESC(D0)→DE(D3)→AFE(D7)→LPOs(D12)→AO(D36);(B)分化验证：各阶段高表达对应标志物(DE：SOX17/FOXA2;AFE：SOX2;LPOs：NKX2.1)。图示明确肺类器官构建的标准化步骤，确保模型可靠性。

图 2：烟草烟雾处理类器官的流程

该图呈现暴露方法：(A)烟雾收集→冷凝物制备→培养基溶解过滤→5 AU/mL CSE 处理类器官;(B)处理后清洗→培养 6 小时→样本收集。图示规范烟草暴露模型的建立，保证实验重复性。

图 3：生理状态下管家基因稳定性

该图分析基础状态结果：(A/G/M)CT 值分布：GAPDH CT 值集中(6-18)，18s 波动大(9-23);(B/H/N)BestKeeper-SD：GAPDH SD<0.3，18s SD>0.8;(D/J/P)GeNorm-M 值：GAPDH M<0.7，18s M>1.1;(F/L/R)综合排名：GAPDH>β-actin>RPS16>RPL19>18s。图示证实生理状态下 GAPDH 最稳定。

图 4：传统香烟暴露下管家基因稳定性

该图对比应激状态：(A/G/M)CT 值：GAPDH 仍集中(5-18)，18s 离散度增加;(B/H/N)BestKeeper-CV：GAPDH CV<5%，18s CV>10%;(D/J/P)GeNorm 排序：GAPDH>β-actin>18s;(F/L/R)综合排名：GAPDH/β-actin 稳居前二。图示说明传统香烟暴露下，GAPDH 仍保持高稳定性。

图 5：加热香烟暴露下管家基因稳定性

该图验证新型烟草影响：(A/G/M)CT 值：GAPDH 波动最小;(B/H/N)BestKeeper-SD：GAPDH<0.4，18s>0.9;(D/J/P)NormFinder 评分：GAPDH<0.2，18s>0.5;(F/L/R)综合排名：GAPDH>β-actin>RPL19。图示明确加热香烟暴露下，管家基因稳定性排序与传统香烟一致。

图 6：组合内参筛选与 SOX2 验证

该图确认最优内参：(A-C)综合评分：GAPDH+β-actin 评分最低(3-7 分);(D-F)SOX2 定量：GAPDH+β-actin 组 SOX2 下调幅度最大(-40% vs 单内参 - 25%)，P<0.01(单内参 P<0.05)。图示证实组合内参的定量准确性更优。

图 7：管家基因筛选总结

该图整合核心结论：(A)模型覆盖：人 / 小鼠肺类器官 + 大鼠肺组织;(B)暴露条件：生理 + 传统 / 加热香烟;(C)内参选择：单内参优先 GAPDH，组合优先 GAPDH+β-actin。图示直观呈现研究成果的应用场景，为后续研究提供指南。

全文总结

本研究的核心价值在于首次建立烟草暴露下肺类器官的管家基因稳定性体系：明确 GAPDH 为最优单内参、GAPDH+β-actin 为最优组合内参，解决了肺类器官研究中内参选择混乱的问题，提升 RT-qPCR 定量的准确性(如 SOX2 检测的显著性增强)。