细胞不贴壁原因分析及解决方法

很多科研小伙伴在培养细胞过程中，可能都有过这样的经历：辛苦呵护的细胞，怎么也不愿意贴壁;贴壁了又很容易成块或者成团掉下来;原本贴壁的细胞，复苏后细胞不贴壁了等各种细胞不贴壁问题，那么遇到这些问题，该如何解决?

培养细胞时如果出现不贴壁现象，其原因是多方面的，在分析细胞不贴壁的原因及解决方法之前，我们先来看下什么是贴壁细胞?贴壁细胞原理?细胞贴壁和什么有关?为啥你的细胞不愿贴壁呢?如何促进细胞贴壁?

细胞不贴壁原因分析及解决方法

根据细胞特性分类

1. 悬浮细胞(Suspension Cell)

细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。

2. 贴壁细胞(Adherent Cell)

在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中的粘附因子才能在该表面生长增殖的细胞。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞或上皮样细胞。

细胞形态

3.兼性贴壁细胞

有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，也可在培养基中呈悬浮状态生长。

贴壁细胞分为：上皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其他形态，而且晃动培养液时，细胞不动。常见的贴壁细胞有成纤维细胞、骨骼组织(骨及软骨)、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞以及各种肿瘤细胞等。

体外培养贴壁细胞特点

贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞贴壁的过程使形态发生很大变化，细胞形态改变是细胞内骨架(真核细胞中的蛋白纤维网架体系，由微管、微丝及中间纤维组成的体系)本身和细胞外基质共同作用的结果。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样，当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37℃时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞间，细胞与底物之间则无;8min后才有稳定的键形成。

贴壁细胞(除肿瘤细胞外)在体外培养条件下，完成贴壁后均为单层生长，原因是贴壁细胞有接触性抑制的特点。一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。由于贴壁细胞的一面是紧贴在培养瓶上的，如果其上方存在细胞与其相粘附，那么下方的细胞很快就会缺乏营养——饿死。

接触抑制

1954年，由艾伯克龙比发现，一些细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂现象，将其命名为接触性抑制(Contact Inhibition)，后来证实接触性抑制普遍存在于贴壁细胞之间。

接触抑制的原理：细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，它在细胞上起识别作用，当细胞增殖到一定程度，挨在一起时，糖蛋白就会识别这种信号，并且使细胞停止繁殖。

单层生长

细胞为什么要贴壁

首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。

密度大于培养基的细胞(绝大部分细胞)通过重力作用会沉降在底面上，这是种自然属性，那么细胞要生存必定得改善这个环境，也是贴壁的主要原因——分泌细胞外基质和粘附因子(Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM)，改善底面的结构，然后很自然就贴附在底面上了。

细胞粘附分子

是众多介导细胞间或细胞与细胞外间相互接触和结合分子的统称。

细胞外基质

是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。

二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物(培养瓶)有关。

原理图

密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上，所以不可能贴在底面上，但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。

细胞贴壁原理及相关因素

大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。

贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面(培养瓶，培养皿的底面)。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。

贴壁过程

一些特殊的促细胞附着物质(如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等)可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其是血清中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。

在细胞培养过程中会出现这样或那样的问题，这些问题从细胞生长角度来说，针对细胞不贴壁、生长缓慢、生长不好，甚至死亡的原因，我们做以下分析并提出相对应的解决方法。

细胞不贴壁的一些原因

1) 胰酶消化时间把控不当：消化不够细胞本身就是成团的;若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。

2) 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。

3) 支原体或细菌的污染。

4) 培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。

5) 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。

6)接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。

7) 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。

如何促进细胞贴壁

1)适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。

2)最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶，那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。

3)正确配制消化液或培养液。

4)使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。

5) 复苏新的细胞。

6)传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。

7)细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。

8) 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。

悬浮细胞成簇可能原因

1)培养液中含钙、镁离子;

2)支原体污染;

3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解;

4)DNA污染 。

悬浮细胞成簇解决方法

1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻巧吹吸细胞获得单细胞悬液;

2)分离培养物，检测支原体;

3)用DNaseI处理细胞。

培养细胞生长缓慢可能原因

细胞长得慢是细胞培养过程中比较常见的问题，一般来说，细胞活力和浓度一直是细胞健康的标志，细胞长得慢的话，活力和浓度可能都会直线下降。

1)由于更换不同培养液或血清;

2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏;

3)培养物中有少量细菌或真菌污染;

4)试剂保存不当;

5)接种细胞起始浓度太低;

6)细胞已老化;

7)支原体污染 。

培养细胞生长缓慢解决方法

1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液;

2)换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子;

3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物;

4)血清需保存在-10到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，需在1周内用完;

5)增加接种细胞起始浓度;

6)换用新的保种细胞。细胞老化(cellular aging)是细胞随生物体年龄增长而发生退行性变化的综合，如果传代前细胞已汇合就会导致其失去黏附性。可以复苏新的保种细胞，重新进行培养。

7)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

培养细胞生长不好可能原因

1)细胞本身的状态;

2)细胞传代次数多，细胞老化;

3)细胞的接种量：接种量过低，细胞生长缓慢;

4)细胞传代时间过晚：细胞中毒，影响传代后的细胞生长;

5)胰酶消化时间过长或过短：时间过长，细胞死亡;时间过短，细胞未完全分离而成团，细胞死亡;

6)细胞的冻存与复苏：慢冻速融;

7)污染：支原体污染、霉菌污染;

8)培养基或血清;

更换血清或培养基之前未进行验证;

选择的培养基是否合适;

培养基配制是否准确无误。

9)培养环境

CO2供应是否正常;

培养箱或摇床温度控制是否正确。

培养细胞生长不好解决方法

根据以上可能原因，做出针对性的解决方案

1)注意细胞的本身状态：如传代次数、接种量等;

2)避免产生污染(用正规、合法、可溯源的血清);

3)要用合适的血清或培养基，最好经过验证;

4)注意实验室的环境。细胞对环境比较敏感，如果操作人员不注意卫生、或工作环境及实验器材出现污染都会导致细胞间的交叉污染，出现不贴壁现象。如果发现支原体污染，及时丢弃培养物。

培养细胞死亡可能原因

1)培养箱内无CO2;

2)培养箱内温度波动太大;

3)细胞冻存或复苏过程中损伤;

4)培养液渗透压不正确;

5)培养液中有毒代谢产物堆积 。

培养细胞死亡解决方法

1)检测培养箱内CO2;

2)检查培养箱内温度;

3)取新的保存细胞种;

4)检测培养液渗透压;

5)换入新鲜培养液。

细胞产品是我们做实验研究的基础，一支小小的细胞，关乎我们各种实验的成功与否，细胞的”小事情“，在实验中都是”大事情“，如果你的细胞出现生长缓慢、不贴壁等情况，那你可要注意了，这就是细胞状态不好的信号，要及时“挽救”，不然很有可能细胞就濒临死亡。

总之，养细胞需要耐心，要温柔，使用品质良好的细胞株和培养基是减少污染的最好方法，同时也是保证细胞生长良好的前提。