细胞系STR鉴定常见问题汇总

细胞系STR鉴定细胞系鉴定(Cell Line Authentication)是指对广泛应用于科学研究和药物开发的模式细胞进行鉴定。在科学研究过程中，如果使用了交叉污染或错误辨识的细胞将导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果等严重问题出现。Nature等机构近年发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定，以确保实验数据的准确性。给细胞系进行验明正身，已成为开展科研工作的首要任务。STR鉴定目前已被ICLAC、ATCC等权威机构作为金标准应用于细胞鉴定越来越多的杂志要求在投稿时提供细胞STR分裂数据。

那么，在细胞系STR鉴定有哪些常见问题

1. 什么是细胞系鉴定

所谓细胞系鉴定即通过STR(短串联重复)图谱所建立细胞系的遗传特征。一株细胞系的遗传特征确立后，细胞系以通过定期的检测，以防止出现细胞系被误认或交叉污染的情况。

2.细胞系鉴定服务流程

STR基因位点由长度为3～7个碱基对的短串连重复序列组成， 这些重复序列广泛存在于人类基因组中，可作为高度多态性标记，被称为细胞的DNA指纹。STR 基因座位上的等位基因可通过扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分，在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别。随后通过一定的计算方法，即可根据所得的STR分型结果与细胞STR数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。

3.细胞系STR鉴定发展历程

一个细胞系，从分离组织到获得一种新的细胞系开始，就应该具有其起源等的详细资料，随着细胞系成为科学研究中重要的工具，所使用的细胞系的真实性、是否发生交叉污染等问题变得越来越重要。显然，科学家们开始并未意识到这个问题的严峻性，以下是细胞系STR鉴定的发展历程，直到今天，还有许多错误鉴定和交叉污染的细胞株，甚至科学家们使用了不正确的细胞系，严重影响了实验结果的真实性。

2001年 PNAS发文Short tandem repeat (STR)profiling provides an international reference standard for human cell lines指出STR分型技术为人类细胞系的鉴定提供了国际参考标准。

2007 年一份生物储存库材料审核结果表明，三分之一或更多的细胞系被错误鉴定或受到污染;NIH发布了通知，强烈建议在使用培养细胞的时候进行鉴定(authentication)。

2008 年底，专家提议ATCC致力于人源细胞系的鉴定工作，并制定鉴定的标准程序。

2009年 Nature发文Identity crisis：It is time for all involved to tackle the chronic scandal of cell-line contamination。

2010年 Nat Rev Cancer ——Cell line misidentification：the beginning of the end。

2011年美国菌种保藏中心(ATCC)制定了人源细胞系STR鉴定标准ANSI Authentication of Human Cell Lines：Standardization of STR Profiling。

2012年Nature发文Cell-line authentication：End the scandal of false cell lines说明了细胞系鉴定的重要性。

2013年Nature旗下杂志要求作者需注明研究中细胞系的来源，避免科学研究因为细胞系有误得出不正确的结果。

2014年12月、2015年2月Science杂志分别发表专题文章，阐述细胞交叉污染和错误辨识的严重性。

2015年4月，Nature旗下所有杂志将要求作者鉴定论文中所用细胞系。

2015年6月即有报道称一科学家因细胞系污染，被Nature撤销发表于其上的论文。

2016年4月中国科学院昆明细胞库公布共60株错误鉴定和交叉污染的细胞系。

4.为什么要进行细胞系鉴定

首先进行细胞系STR鉴定是很重要的。很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行，这些细胞可能是受赠于其它研究人员，也可能是从细胞库(如美国ATCC ,American Type Culture Collection)得来。 据估计，15-20%的实验室， 实验中所使用的细胞已经不是原来的细胞系，或者与其它细胞系发生了交叉污染。显然，细胞系遭到污染、特征鉴别错误，将会极大的威胁着基于这些细胞而发表的论文质量和研究发现的正确性。为此，很多细胞库现在都要对提交来的细胞系进行鉴定，并对细胞系之间的交叉污染进行监测。

现在很多机构都已经认识到这个的重要性，ATCC和FDA,这些机构要求对用于制药领域的实验中所使用的材料，如细胞系，应该进行“身份鉴定和纯度测试。很多杂志也要求使用细胞系的文章提供STR指纹图谱数据。FDA建议研究人员在培养细胞的较早阶段(细胞培养第一周)来鉴定细胞系的身份。细胞在被冻存前应再一次进行鉴定; 对于活跃生长的细胞，每两个月应鉴定一次;文献发表前也应对细胞系身份进行鉴定。如果一个实验室使用不止一种细胞系，则应在实验最开始时，就要对所有的细胞系进行鉴定，以便排除交叉污染。这样将减少由于细胞系发生交叉污染或身份误认，将导致实验数据的无效或数据误导。

由于细胞系发生交叉污染或身份误认，将导致实验数据的无效或数据误导。NIH已发出公告，讨论细胞系鉴定的必要性与重要性，并且越来越多的的期刊要求文章发表前、需提供细胞鉴定数据。

目前要求提供细胞鉴定数据的期刊有：

Nature

Nature Cell Biology

Nature Methods

AACR Journals

Cancer Research

Clinical Cancer Research

Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention，CEBP

Cancer Prevention Research

Molecular Cancer Research

Molecular Cancer Therapeutics

Cancer Reviews Online

Prevention Portal

Cancer Discovery

Cancer Immunology Research

International Journal of Cancer

Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism

Journal of Endocrinology

Journal of Molecular

Journal of Molecular Biology

Journal of the National Cancer Institute

BioTechniques

Carcinogenesis

Cell Biochemistry and Biophysics

Cell Biology International

Clinical Orthopaedics and Related Research

Endocrine Reviews

Endocrine-Related Cancer

Endocrinology

In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal

Molecular Endocrinology

Molecular Vision

Neuro-Oncology

PLoS ONE……

5. 细胞系用错的概率有多大

据ATCC估计，1977年错误使用细胞的概率是16%，1999年是18%。根据我们的经验，国内细胞系用错的概率不低于20%;即如果一个研究所有二十个课题组，按概率估计，有4个课题组用的细胞是错的。

6. 什么时候需细胞系鉴定

1) 当建立或获得一个新的细胞系时

2) 一个涉及到细胞试验项目开始/结束时

3) 在细胞冻存之前，或细胞已连续培养 2～3 个月时

4) 发表文章或申请课题经费前

5) 细胞系表现不稳定或结果与预期差别较大时

6) 当实验室使用超过一种细胞系时，所有细胞系最好先鉴定以排除交叉污染的可能

7.细胞STR鉴定技术原理

由于STR技术具有灵敏度高(最低可检出0.1ng DNA)、自动化程度高、准确快速、重复性好等优点， STR基因分型已被作为金标准应用于细胞鉴定。

STR(Short Tandem Repeat，短串联重复序列)基因位点由长度为3～7个碱基对的短串连重复序列组成，这些重复序列广泛存在于人类基因组中，可作为高度多态性标记，被称为细胞的DNA指纹。STR已被广泛应用于亲子鉴定、个体识别、司法鉴定、交通事故鉴定、(造血干细胞)移植治疗后嵌合情况监测等领域。STR基因座位上的等位基因可通过PCR(聚合酶链式反应)扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分，在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别，随后通过一定的计算方法，即可根据所得的STR分型结果与专业的细胞STR数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。

8.有些细胞系是自己实验室发现的，在ATCC等细胞库中没有入库，能否做细胞鉴定

能，虽然在数据库中没有其STR数据，但我们仍建议您进行细胞STR鉴定，因为我们的试剂盒是针对基因的多态性位点进行扩增，无论是哪个种属的细胞均能得到扩增，另外通过该项检测，您可以：

1)判断培养的细胞是否被其他细胞交叉污染及其可能被污染的细胞名称;

2)您将是第一个得到该细胞系STR数据(DNA指纹)的人;

3)申请将该细胞系的STR数据保存于权威的数据库中。

9.可以对哪些物种进行细胞鉴定

人源的细胞系(包括人干细胞)和小鼠的细胞系在实验室中最为常见，我们主要针对这两种细胞进行鉴定;另外，还可以鉴定人源细胞中的鼠源细胞污染，鉴定猴源的细胞;目前正在开发猪、狗的细胞鉴定体系。

10.如何提供鉴定样本

每种细胞需单独收集在 1.5ml 离心管中，细胞数目不少于 10的6次方个。细胞需要离心沉淀，并且以 PBS 清洗尽可能去除上清培养基，沉淀沉淀进行冰冻保存与寄送。

11. 如何知道细胞系是否发生交叉污染了

如果存在细胞系之间发生交叉污染，而且鉴定用的细胞可能有两种以上的细胞系时，那么在进行 STR 位点检测的时候，多个位点会出现两个以上的峰。峰高值表示该等位基因的信号强度，理论上峰值与样本的 DNA 浓度有直接的关系。因此，存在交叉污染的混合细胞系中，其中一个位点中某些峰会明显高于其他的峰，其中大峰是属于混合细胞系中那个主要细胞系，而小峰则属于那个次要细胞系。

值得注意的是，当发生两个或以上细胞混合的时候，检测结果看起来非常像细胞系的“遗传不稳定”——当一个细胞系存在亚群时，尤其是一些癌细胞系， 由于遗传不稳定的存在，在一些位点的 STR 特性会不同。因此经验丰富的分子专家是非常重要的，他能够帮助分析复杂的电泳图谱(STR 峰图)，从而判断是否由于发生细胞系交叉污染而导致多等位基因情况。

12. 如何根据 STR 数据判断细胞系的身份

收到细胞系鉴定结果以及 STR 信息，可以与参考数据库进行比对。如果细胞样本的每个 STR 位点和参考细胞 STR 位点都能重合匹配，即说明该细胞系正确，反之则说明你的细胞系可能被错误标记，交叉污染或发生遗传不稳定。一般说来，匹配度≥80%即可认为该细胞系正确，匹配度<80%则说明该细胞系的来源需要被怀疑。

如果细胞系被鉴定出发生交叉污染或错误标记，则需要拿更早代数的细胞进行鉴定，从而找到问题的起源或者直接从可靠的机构购买一株新的细胞系。

13. 如果细胞系没有在数据库中比对出结果怎么办

如果已知数据库中没有找到你的细胞信息，你可以用自己的细胞遗传信息建立自己的遗传特性，以便后期进行自己细胞库的比对。

14.为什么报告内最终结论，会出现匹配不上任何已知数据情况

最大的可能性是因为这株细胞的标准序列并没有收录在国际的细胞库之中，导致送检样本与任何的序列都不匹。出现这种情况大多数是因为该细胞系，可能是由国内课题组自主建系的。

15.在做细胞STR检测时为什么选择的位点有些并未出现在ATCC、JCRB、DSMZ等数据库中

目前这些数据库中发布的都是9位点比对，且这9个位点相同。为了更好的进行细胞分型，鉴定是否被污染，除选择标准的9个位点以外，还设计鉴定其他位点，追求更高的准确性。

16. 细胞系交叉污染或错误鉴定对研究是否有影响

答案是肯定的。使用错误的细胞系或者是被污染的细胞系做研究，只会造成时间，金钱和精力的损失，以及造成实验结果的不一致和不可重复。因此如果用被污染或错误的细胞系做研究，在发表文章或做进一步研究时极有可能需要用正确的细胞再重复实验。

17. 用错细胞时间最长的持续了多少时间

瑞典有一个科学家，在三十年的时间里都以为自己的细胞是正确的，直到做了细胞鉴定之后发现是错误的。越早发现错误越好，鉴定之后是正确的话，自己也放心。

18. 为什么报告内最终结论，会出现匹配不上任何已知数据情况

最大的可能性是因为这株细胞的标准序列并没有收录在国际的细胞库之中，导致送检样本与任何的序列都不匹。出现这种情况大多数是因为该细胞系，可能是由国内课题组自主建系的。

19. 国内有类似的 STR 标准数据库吗

是有的，这个是协和医院官方建立的一个国家实验细胞资源共享平台，cellresource.cn / 在里面约会收录一些国内自主建系的细胞的标准序列。

20. 对于STR位点引物设计有什么要求吗

设计其实很简单，并且很容易使用。但是由于这个位点的选择和优化是非常枯燥并且耗时耗力的工作，建议由专业的服务方进行设计和合成。

21. 除了检测人源的细胞株，还可以检测其他动物的细胞或者原代细胞吗

技术上是可以检测的。但是鼠源细胞在结果上跟人源细胞有明显的区别。鼠源一个 STR 位点会出现上百个重复，只能证明待测样本不是人源的样本。但是属于小鼠的具体哪一种细胞株，无法确定，因此也不能排除鼠源细胞之间出现交叉污染的可能。

至于人的原代细胞，由于国际上的数据库里面没有收录原代细胞标准序列，最终的检测结果也是匹配不上任何的已知序列的。