hiPSC人多能干细胞（STR鉴定报告）

货号：IM-H523

规格：1x10⁶cells/T25或1mL冻存管

形态：球形克隆，贴壁生长

培养基：hiPSC人类诱导多能干细胞完全培养基

传代比例：1:2至1:3，每周 2-3次

价格：¥5000

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背景介绍培养操作冻存步骤售后服务

背景简介

hiPSC细胞株来源于ATCC，是将健康男性新生儿包皮细胞诱导成hiPSC，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

一、细胞基本属性
细胞名称	hiPSC人多能干细胞（STR鉴定报告）
细胞别称	hiPSC；人类诱导多能干细胞；人多能干细胞
种属来源	人/男性
组织年龄	内细胞团
生长特性	贴壁生长
细胞形态	球形克隆
细胞荧光检测	人多能干细胞hiPSC培养鉴定实验报告
细胞规格	1×10⁶cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装
支原体检测	无
培养基	hiPSC人类诱导多能干细胞完全培养基
冻存条件	无血清冻存液，液氮储存
细胞货期	现货，1周左右
发货方式	复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用）顺丰快递
特别说明	以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主
二、细胞培养操作
试剂准备		1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL） 1.在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。 2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。 3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。 2）Matrigel铺板（以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例） A. 分装 Matrigel 1.货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。 2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。 3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。 4.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。 5.混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。 6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。 B.铺板 1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。 2.1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。 3.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。 4.用预冷吸头向解冻过的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。 5.吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。 6.分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。 7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。
复苏方法		1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。 2. 取4 mL hESC/iPSC完全培养基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。 3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。 4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。 5. 吸弃上清，加入预温的4 mL的hESC/iPSC完全培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。 6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。 7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。 8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。注：在hESC(H1)培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。
传代方法		传代hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代； ② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。 2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(C-D)所示），建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔（以6孔板为例）。 3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。 4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。 5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。 6. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。 7. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。 8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。 9. 置于37℃培养箱中孵育8-9 min。注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间； ② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。 10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。 11. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。 ②hESC(H1)细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。 12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。 13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。 14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。 15. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
注意事项	1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。 3. 冻存细胞发货2管，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复苏第二支。 4. 申请售后时请提供细胞收货时及反馈售后当天细胞清晰照片及培养信息，建议客户在细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。 5.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。 6. 细胞在不同实验室培养由于所使用培养基及血清品牌、个人操作习惯、培养瓶品牌等诸多培养条件不尽相同，导致细胞培养形态、生长速度、贴壁情况均可能有所差异，对于此类细胞适应环境生长的行为，不予过度解释或免费售后。
备注：客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术服务电话：400-080-3389 按 2，我们随时给予解答。
三、细胞冻存操作
冻存液配方	无血清冻存液，液氮储存
细胞密度	待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例
冻存方法	3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例） 1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。 2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。 3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。 4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。 5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min（可参考“六、传代hESC/iPSC”步骤）。 6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。 7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。 8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
注意事项	冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案