hESC（H9）人胚胎干细胞（STR鉴定报告）

背景简介

hESC（H9）细胞株来源于人胚胎干细胞，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。人胚胎干细胞H9，曾用名WA09。每支细胞可复苏至一个T25，3至4天后会形成30至40个克隆。

细胞产品信息

细胞名称	hESC（H9）人胚胎干细胞
细胞别称	hESC; HT clone H9; HT(H9); H 9; H-9; 人胚胎干细胞
种属来源	人
组织来源	人胚胎干细胞
生长特性	贴壁生长
细胞形态	克隆状细胞样
STR位点	Amelogenin：X,Y;CSF1PO：11;D2S1338：20,25;D3S1358：15,16;D5S818：11;D6S1043：12;D7S820：8,11;D8S1179：12,14;D12S391：18,23;D13S317：8,12;D16S539：11,12;D18S51：18;D19S433：14;D21S11：30;FGA：21,25;PentaD：9;PentaE：13,15;TH01：8,9;TPOX：8,9;vWA：14,15
STR鉴定图片
细胞荧光检测	人胚胎干细胞H9培养鉴定实验报告下载
细胞代数	10代以内
细胞规格	1x106cells/T25或1mL冻存管
支原体检测	无
保藏机构	中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
培养基	H9人胚胎干细胞完全培养基
培养条件	气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃
冻存条件	无血清冻存液，液氮储存

试剂准备

1)hESC/iPSC完全培养基配制(500 mL)

1. 在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。

表 1：hESC/iPSC完全培养基配置说明*

可根据实际用量将hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表3的配置说明。 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B冻融总次数不能超过2次。

2)Matrigel铺板(以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例)

A. 分装 Matrigel

1. 货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。

2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人;1mL无菌吸头;EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。

3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。

5. 混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解冻至完全化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷吸头向解冻过的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。

5. 吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。

细胞培养操作

1)复苏hESC/iPSC(以6孔板为例)

1. 将水浴锅预热至37℃;并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(15~30℃)。

3. 取4 mL hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温(15~30℃)。

注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。

4. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。

5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。 6. 吸弃上清，加入预温的2 mL的hESC/iPSC完全培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。

7. 吸除6孔板中1孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。

8. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。

9. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。

注：在hESC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。

表2：hESC/iPSC传代&培养操作试剂推荐用量

培养容器(孔数)底面积DPBS (mL)EDTA传代工作液hPSC培养基*

2)传代hESC/iPSC(以6孔板为例)

1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)，一般情况下每3-4天传代;

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀(如图1(C-D)所示)，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。

3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。

4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温(~25℃)。

5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。

6. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。

7. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。

8. 置于37℃培养箱中孵育5-6 min。

注：① 消化5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;

② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。

图1. hESC/iPSC完全培养基连续培养hESC细胞形态图：(A)和(B)分别为hESC细胞培养第2和4天时低倍镜hESC培养形态图示，(C)和(D)为培养至第2和4天时的高倍镜hESC培养形态图。

9. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

10. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。

注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

图2：消化hESC细胞不同时间形态图：(A)消化5 min低倍镜hESC培养的的形态图;(B)消化6 min低倍镜hESC培养的的形态图。

② hESC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔(六孔板)。

11. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

12. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤8获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次;再按照传代比例接种。

13. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。

14. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。

3)冻存hESC/iPSC(以6孔板为例)

1. 当细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。

2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时5-6 min(可参考“六、传代hESC/iPSC”步骤)。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

收货注意事项

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

5. 该细胞仅供科研使用。