hESC（H9）人胚胎干细胞（STR鉴定报告）

背景简介

hESC（H9）细胞株来源于人胚胎干细胞，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。人胚胎干细胞H9，曾用名WA09。每支细胞可复苏至一个T25，3至4天后会形成30至40个克隆。

细胞产品信息

细胞名称	hESC（H9）人胚胎干细胞
细胞别称	hESC; HT clone H9; HT(H9); H 9; H-9; 人胚胎干细胞
种属来源	人
组织来源	人胚胎干细胞
生长特性	贴壁生长
细胞形态	克隆状细胞样
STR位点	Amelogenin：X,Y;CSF1PO：11;D2S1338：20,25;D3S1358：15,16;D5S818：11;D6S1043：12;D7S820：8,11;D8S1179：12,14;D12S391：18,23;D13S317：8,12;D16S539：11,12;D18S51：18;D19S433：14;D21S11：30;FGA：21,25;PentaD：9;PentaE：13,15;TH01：8,9;TPOX：8,9;vWA：14,15
STR鉴定图片
细胞荧光检测	人胚胎干细胞H9培养鉴定实验报告下载
细胞代数	10代以内
细胞规格	1x106cells/T25或1mL冻存管
支原体检测	无
保藏机构	中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
培养基	H9人胚胎干细胞完全培养基
培养条件	气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃
冻存条件	无血清冻存液，液氮储存

试剂准备

1)hESC/iPSC 完全培养基配制(500 mL)

1. 在 4℃条件下解冻 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在 37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表 1 在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成 hESC/iPSC 完全培养基，之后置于 4℃储存，封口膜封好后 2 周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置 100 mL,保证 2 周内使用完毕。

表 1：hESC/iPSC 完全培养基配置说明*

可根据实际用量将hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表3的配置说明。hESC/iPSC GrouthSupplements A/B 冻融总次数不能超过 2 次。

2)Matrigel 铺板(以货号为 354277 的 Corning® Matrigel®包被 6 孔板为例)

A. 分装 Matrigel

1. 货号 354277 的 Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推荐 Dilution Factor 为 278 μL，则表明 278 μL 可包被 4 块 6 孔板，分装数量=5 mL/0.278=17.98。

2. 准备 18 个无菌 1.5 mL EP 管，标记 Matrigel 日期、操作人;1mL 无菌吸头;EP 管架，均置于-20℃冰箱中预冷 1 小时。

3. 将 Matrigel 放置 4℃冰箱过夜解冻，当 Matrigel 完全解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将 Matrigel 放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。5. 混匀 Matrigel，无菌分装于各个 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 离心管中，准备 4 个 6 孔板，标记 Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL 无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷 1 小时，取出一支冷冻的 Matrigel(278μL)置于 4℃冰箱解冻至完全化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1mL 吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷吸头向解冻过的 Matrigel(278μL)加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 并反复吹打解冻混匀。

5. 吸出已解冻混匀的 Matrigel 加入离心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装 1.5 mL/孔于 4 个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温 1 小时后即可使用，或置于 4℃冷藏过夜，两周内使用。

三、细胞培养操作：

1)复苏 hESC/iPSC(以 6 孔板为例)

1. 将水浴锅预热至 37℃;并将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(15~30℃)。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 完全培养基，加入 hESC/iPSC Supplement C 终浓度为 10uM，恢复至室温(15~30℃)。

注意：不要在 37℃水浴锅中预温培养基。

4. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min 内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。

5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL离心管中，随后缓慢逐滴加入 10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g 离心 5 min。

6. 吸弃上清，加入预温的 2 mL 的 hESC/iPSC 完全培养基+hESC/iPSC Supplement C 制备细胞悬液，尽量避免吹打。

注：可留 20 μL 上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。

7. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，将细胞悬液按照 2 mL/孔接种到 1 个孔中。

8. 水平十字摇匀三次，置于 37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。

9. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，之后每天更换培养基。

注：在 hESC 培养过程中，如果细胞的汇合度超过 50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至 3-4mL/孔。

表 2：hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量

2)传代 hESC/iPSC(以 6 孔板为例)

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 85%左右(如图 1(C-D)所示)，一般情况下每 3-4 天传代;

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度 85%，大小均匀(如图 1(C-D)所示)，建议按照 1:8 进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔瓶传 8 个孔(以 6 孔板为例)。

3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基，加入 hESC/iPSC Supplement C 终浓度为 10uM，恢复至室温(~25℃)。

5. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

6. 将孔内培养基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。

7. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆盖孔底。

8. 置于 37℃培养箱中孵育 5-6 min。

注：① 消化 5-6 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。

图 1. hESC/iPSC 完全培养基连续培养 hESC 细胞形态图：(A)和(B)分别为 hESC 细胞培养第 2 和 4天时低倍镜 hESC 培养形态图示，(C)和(D)为培养至第 2 和 4 天时的高倍镜 hESC 培养形态图。

9. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

10. 及时加入 2 mL/孔预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃 6 孔板使细胞脱离基质。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C 时，可轻柔吹打细胞 1-2 次，不能超过 2 次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大

量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

图 2：消化 hESC 细胞不同时间形态图：(A)消化 5 min 低倍镜 hESC 培养的的形态图;(B)消化 6 min低倍镜 hESC 培养的的形态图。

② hESC 细胞不能长时间处于 hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过 4 孔(六孔板)。

11. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

12. 在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤 9 获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤 8 获得的细胞悬液收集至 2mL 离心管，轻柔颠倒混匀细胞 1-2 次;再按照传代比例接种。

13. 接种后，水平十字摇匀 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀 6 孔板三次，培养过夜。

14. 18-24 小时后更换新 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，4-5 天后继续传代/冻存。

3)冻存 hESC/iPSC(以 6 孔板为例)

1. 当细胞汇合度达 85%左右(如图 1(C-D)所示)可收获冻存，一般 6 孔板每孔可冻存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于 37℃培养箱中，计时 5-6 min(可参考“六、传代 hESC/iPSC”步骤)。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀 3 次，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

收货注意事项

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

5. 该细胞仅供科研使用。

人胚胎干细胞hESC H9细胞文献溯源

2000年始，迄今为止，关于hESC(H9)人胚胎干细胞的文献有340篇。

在pubmed数据库中用“human embryonic stem cells H9”搜索该关键词，第一篇为2000年M Amit 在“Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture”。

H9人胚胎干细胞应用领域

研究人员可以使用H9细胞来建立帕金森病的细胞模型。例如，通过向H9细胞中引入导致帕金森病的特定基因突变，研究人员可以观察到与帕金森病相关的细胞变化，如多巴胺能神经元的死亡。

制药公司可以使用H9细胞来评估新药对特定疾病的影响。例如，通过向H9细胞中加入某种药物，研究人员可以观察药物是否能够阻止或逆转疾病相关的细胞变化。

在骨骼组织工程研究中，研究人员可以将H9细胞定向分化为成骨细胞，然后将这些细胞种植在生物材料上，以构建新的骨骼组织。

在心脏组织工程中，研究人员可以将H9细胞定向分化为心肌细胞，然后将这些心肌细胞种植在心脏补丁上，以修复受损的心脏组织。

研究人员可以使用CRISPR/Cas9技术对H9细胞进行基因编辑，以研究特定基因在疾病发生中的作用，或开发治疗遗传性疾病的策略。

通过基因编辑，研究人员可以纠正导致疾病的基因突变，然后将这些编辑后的细胞用于治疗。

hESC H9人胚胎干细胞标志物

人胚胎干细胞(hESC，H9)的标志物包括Oct-4、Sox-2、Nanog、Fragilis、Tra-1-81、Tra-1-60、SSEA-3、SSEA-4、Trop-1和SPARC等。这些标志物对于识别和研究hESC(H9)胚胎干细胞至关重要。