Optimal 8培养基

产品描述

Optimal 8培养基(简称O8培养基)是研发技术团队开发的一种适用于无饲养层培养、专为人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的生长和扩增而配制的无血清培养基，无动物源成分，化学成分明确。O8培养基已被用于扩大 hESC/iPSC 的生产，并被证明可以支持hESC(H1) 生长 >30 代，且没有任何分化迹象，同时保持分化三胚层的能力。

O8可与本公司铺板工作液配合使用，进行hESC/hiPSC的扩增与建库。

产品规格

1 Kit，2℃~-20℃储存

产品信息

表1. O8产品内容

表2. hESC/iPSC 其他相关试剂产品内容

图 1.O8培养基与竞品E8培养基连续培养hESC(H1)20代后 细胞形态图：(A)和(C)分别为竞品E8培养基培养至第20代，低倍镜和高倍镜下 H1 培养形态图示，(B)和(D ) 为O8培养基培养至第20代，低倍镜和高倍镜下 H1 培养形态图示。

图 2.O8培养基与竞品E8培养基连续培养hESC(H1)20代后进行多能性指标OCT4、NANOG、LIN28的IF鉴定图：(A)、(B)、(C)分别为竞品E8培养基培养至第20代后OCT4、NANOG、LIN28的IF鉴定图，(D)、(E)、(F)为O8培养基培养至第20代后OCT4、NANOG、LIN28的IF鉴定图。

实验试剂与材料

表3. 推荐试剂&材料

试剂准备

1)O8 培养基配制(500 mL)

1. 在 4℃条件下解冻 Optimal 8 Supplement，勿在 37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 在生物安全柜中，使用无菌移液管将 Optimal 8 Supplement 与Optimal 8 Basal Medium

混匀配制成O8培养基，之后根据使用情况将培养基分装，封口膜封好，确保置于 4℃储存的培

养基 2周内使用完毕，其余培养基于-20℃冷冻保存，需要时提前于 4℃过夜解冻。

2)Laminin521 铺板(以6孔板为例)

1. Laminin521浓度为0.13mg/mL，推荐铺板浓度为0.5μg/cm²，铺板时按照231μL Laminin521 和6mL DMEM/F12的比例进行稀释，不同细胞板的推荐铺板用量如下：

表4. hESC/iPSC 培养推荐铺板用量

2. 取6 mL 冷藏 DMEM/F12 于15 mL 离心管中，准备 1 个6孔板，标记 Laminin521 、日期和操作人。

3. 1 mL 无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1 小时，取出一支解冻的Laminin521。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Laminin521 、预冷的1mL 吸头放置于生物安 全柜上。

5. 用预冷的吸头吸取231 μL Laminin521，加入6 mL 冷的 DMEM/F12 中，使用10 mL 移液管反复吹打混匀(20次左右)。

6. 分装 1mL/孔于6孔板中，水平十字摇匀。6孔板用封口膜封好，置于2-8℃过夜后使用;如果要立刻使用，至少在37℃ 培养箱 放置2小时后使用。铺好的板可以在2-8℃ 保存1-2周。

复苏 hESC/iPSC(以 6 孔板为例)

1. 将水浴锅预热至 37℃;并将 Laminin521 包被的6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时 恢复至室温。

2. 取 2 mL O8培养基，加入 4μL iPS Y27632 使终浓度为10μM，取 9mL DMEM/F12，加入 18μL iPS Y27632 使终浓度为 10μM，恢复至室温。

注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。

3. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min 内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。

4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入 9mL DMEM/F12，将离心管轻轻缓慢上下颠倒混匀，160g 离心 5 min。

5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 包被液，加入 2mL 含有 iPS Y27632 的 B8 完全培养基。

6. 离心完吸弃上清，至留下 50μL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，

逐滴缓慢加入 1mL 含有 iPS Y27632 的O8培养基，轻弹管底 3-4 下 混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有iPS Y27632 的 O8培养基中。

7. 水平十字摇匀三次，置于 37℃, 5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字 摇匀三次培养。

注：水平十字摇匀 3 次，左右两次+上下两次算一次。

8. 18-24 小时后换新的O8完全培养基，之后每天更换培养基。

表5. hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量

传代 hESC/iPSC(以 6 孔板为例)

图 3.O8培养基连续培养 hESC(H1) 细胞形态图：(A)和(B)分别 为 hESC 细胞培养第 2 和 4 天时低倍镜 hESC 培养形态图示，(C)和(D ) 为培养至第 2 和 4 天时的高倍镜hESC 培养形态图。

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 70%左右(如图 3(B-D)所示)，一般情况下每 3-4 天传 代;

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正 常，克隆团汇合度 85%，大小均匀(如图 3(B-D)所示)，建议按照 1:8 进行传代，如果密度 偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔传 8 个孔(以6 孔板为例)。

3. 将 Laminin521 包被的 6 孔板，hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，DPBS 提前放置生物安全柜 中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 O8完全培养基，加入 iPS Y27632 终浓度为 10μM，恢复至室温(~25℃)。

5. 将细胞六孔板孔内培养基吸弃，加入 1 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃后吸弃。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，使溶液完全覆盖孔底。

7. 置于 37℃培养箱中孵育 7-9 min。

注：① 消化 7-8 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基 质，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间，不超过 10min;

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。

图4：在Laminin521上生长hESC 细胞使用hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)消化8min状态图。

8.消化时吸取 6 孔板中的 Laminin521溶液，加入预温的 O8 培养基+ iPS Y27632 2 mL/孔。

9.消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)。吸取 1 mL/孔预温的O8 完全培养基+ iPS Y27632，将细胞吹下来。

注：① 吸取 O8 培养基 + iPS Y27632 吹打细胞时，轻柔吹打，不能超过 2 次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

10.把这一毫升细胞悬液悬空滴加入板里的培养基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上标记细胞名 称、代次、传代比例、日期、操作人，水平十字摇匀 3 次。

注：可将传完代后的细胞在镜下观察细胞密度，根据密度调整是否需要多加细胞滴;如操作时间较久，应及时把细胞悬液移至离心管中，避免细胞再次贴壁。

11.置于37℃,5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀 3 次，不要叠放。

12. 18-24 小时后换新的 O8 培养基，此后每天换液，第 4 天继续传代/冻存。 注：传代后隔天算第 1 天。

冻存 hESC/iPSC

1. 当细胞汇合度达 70%左右(如图 3(B-D)所示)可收获冻存，一般 6 孔板每孔可冻 存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution ，使用前注意摇匀，吸取所需用量(1mL/孔)，加入 iPS Y27632，使终浓度为 10μM。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，将细胞置于 37℃培养箱中，计时 7-9 min(可 参考“六、传代 hESC/iPSC”步骤)。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)。

7. 吸取 1mL hESC/iPSC Cryopreservation Solution ，轻柔吹打1-2次，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

其他培养体系中 hESC/iPSC 更换为 O8完全培养基条件的适应

其他无饲养层条件培养的 hESC/iPSC 可以在细胞状态良好时，使用原培养基进行细胞传代，24 小时后更换成混合培养基(原培养基与O8培养基按照 1:1 混合)培养，培养 2 代后完全换成 O8培养基培养，培养 2-3 代后可完全适应新的培养体系，此时可进行细胞冻存处理。