小鼠脾脏CD4+T细胞分离培养及标志物鉴定介绍

背景简介

CD4+T细胞指的是表面有CD4分子的T淋巴细胞，是外周淋巴组织中的初始T细胞在受到抗原攻击后分化产生的一种效应T细胞，主要通过产生细胞因子参与细胞免疫。

作为淋巴细胞的主要组分，CD4+T细胞具有多种生物学功能，如产生多种细胞因子直接杀伤靶细胞，调节B细胞活化并产生抗体，并与其它的免疫细胞细胞共同协作，保护机体免受病原体以及肿瘤的侵害。

细胞基本信息

细胞名称：小鼠脾脏CD4+T细胞

分离方法：磁珠分选

组织来源：C57小鼠脾脏

细胞形态：圆形、淋巴母细胞样

生长特性：悬浮生长

细胞形态

小鼠CD4+T细胞是一种悬浮细胞，细胞形态呈圆形，细胞可传5代左右；3代以内状态最佳。

小鼠脾脏CD4+T细胞特点

1.免疫识别

在CD4共受体和T细胞受体(TCR)-CD3复合物的共同作用下，TCR识别抗原MHC II复合体，同时在细胞因子的作用下，CD4+T细胞增殖活化并发挥免疫学功能;

2.细胞杀伤

通过分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子促进CD8+T细胞的增殖和颗粒酶的释放或直接杀伤肿瘤细胞，从而更有效的发挥肿瘤免疫功能;

3.可分化为多个亚群

CD4+T细胞具有极强的可塑性，其可极化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞等效应细胞，从而在疾病中发挥不同作用;

4.免疫调节功能

除了促进CD8+T细胞活化外，在CD4+T细胞产生的多种细胞因子中，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子也是调节B细胞、NK细胞等细胞活化的关键细胞因子

5.免疫记忆功能

CD4+记忆T细胞机体受到病原体的二次侵入时，可在抗原提呈细胞的作用下再次增殖分化，从而更快速的发挥免疫杀伤作用。

小鼠脾脏CD4+T细胞分离培养步骤

材料准备

工具：4-6周C57小鼠、小鼠CD4+T 细胞分选试剂盒 、红细胞裂解液、眼科镊、眼科剪、细胞筛网、PBS缓冲液、小鼠脾脏CD4+T 细胞专用培养基

提前开启紫外线照射超净台30min：将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 min。HBSS缓冲液缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 min以上。

培养瓶：准备25cm2的培养瓶。

操作步骤

1.处死小鼠，无菌取出脾脏，在70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于 50 mL 离心管中，500 g，离心5 min。

2.离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液(ACK)，室温裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g， 离心5 min。

3.将脾细胞重悬于PBS，细胞悬液用70 μm 细胞筛网过滤后，计数，调整细胞密度为1×108 cells/mL。

4.按照每100 μL 细胞悬液(1×107个细胞)对应2 μL Biotin-Antibody Mix加入无菌流式管底部，混匀后 4°C 孵育10 min。

5.孵育完成后，在流式管中加入 20 μL Streptavidin磁珠 (1×107个细胞)(使用前涡旋振荡重悬磁珠，确保磁珠完 全重悬)，混匀后4°C 孵育10 min。

6.孵育完成后，在流式管中加入2.5 mL分选buffer，用移液器上下混合吹打5次混匀(避免剧烈振荡或者 上下颠倒混匀)。

7.将含有细胞的流式管置于磁力架上，静置5 min。将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中(倾倒过程中流式管不要脱离磁力架)，此细胞悬液中即包含 纯化的小鼠CD4+T细胞，500 g，离心5 min。离心后弃上清，收集细胞， 将细胞重悬于培养基中，即可用于后续扩增。

细胞标志物鉴定

CD4是CD4+T细胞重要的标记物,也是识别CD4+T细胞最可靠的标志。

小鼠脾脏CD4+T细胞培养注意事项

轻轻吹打T25细胞培养瓶中的培养基使细胞悬浮。

吸取培养瓶中所有培养基，在离心机中以1000转离心5分钟。

弃去上清，加入新的培养基重悬，于培养瓶中培养。

建议1：2传代。

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

根据细胞数量加入专用的淋巴细胞冻存液，使细胞密度5x106~ 1x107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。

小鼠脾脏CD4+T细胞研究应用

研究

CD4+T细胞是人体中最重要的T细胞亚群之一，并且可进一步‌细分为更多亚群，其功能的发挥主要依靠产生多种细胞因子作用于不同的细胞，‌在保护机体免受病原体和肿瘤侵害方面发挥重要的调节作用。‌

实验研究：通过分离培养CD4+T细胞并检测其产生的细胞因子类别以便于在体外研究诱导CD4+T细胞活化及其引起炎症反应的分子机制，从而通过药物等方法调节CD4+T细胞活力以达到治疗疾病的目的。

应用

TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）疗法

‌从患者体内提取肿瘤组织中的T细胞，‌并在实验室中扩增和改造，‌使其能够更有效地识别和攻击癌细胞，目前已有研究表明通过使用改造后的CD4+T细胞的TCR疗法显著消除了患者肿瘤。

TCR（T细胞受体）疗法

通过提取患者的CD4+T，‌并在其中加入一个可以表达T细胞受体的基因，‌使T细胞产生特异性的T细胞受体，‌从而能够更加有效的发挥CD4+T细胞功能，目前对于CD4+T细胞改造的应用已取得一定成效。

CAR-T（嵌合体抗原受体T细胞）疗法

‌从患者组织中提取T细胞，‌通过基因改造加入一种制造嵌合体抗原受体的基因，‌使改造后的T细胞能够特异性地识别和杀伤靶细胞，虽然目前对于CAR-T疗法的研究以CD8+T细胞为主，但CD4+T细胞在CAR-T疗法中的作用也越来越受到关注。