人脂肪间充质干细胞提取制备鉴定分离实验流程

今天给大家分享的是关于原代人脂肪间充质干细胞提取制备鉴定分离实验流程，在提取细胞前，需要老师准备相应的人脂肪干细胞专用培养基、专用消化酶、0.25% 胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素等试剂。

人脂肪间充质干细胞提取制备鉴定分离实验流程

实验材料

人脂肪主要试剂

人脂肪干细胞专用培养基、专用消化酶、0.25% 胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素

人脂肪间充质干细胞提取操作步骤

(1)将无菌条件下取约5 g腹部皮下脂肪，用含有 500 U/ml 双抗的 PBS 充分漂洗 3 遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，用眼科剪将其充分剪碎，再用 PBS 反复冲洗，尽量除去红细胞；

(2)加入 2 倍体积的专用消化酶，振荡混匀后，于 37 ℃的恒温水浴箱消化 60 min；

(3)加入等体积的含有 10% FBS 的培养基终止消化；

(4)1 800 r/min 离心 10 min(离心后分为 3 层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀)；

(5)弃上层和中层，加入 2 ml 专用培养基重悬细胞沉淀，70 μm 细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为 1×108/L 接种至 60 mm 细胞培养皿中，于 37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养；

(6)将提取的原代 ADSCs培养 24 h 后进行半量换液，48 h 后进行全量换液，去除残存的红细胞、细胞碎片等。之后每 2 d换液 1 次。

人脂肪间充质干细胞传代

获得纯化后的 ADSCs，培养 7~9 d 后，原代 ADSCs 可生长融合达到 90%，用 0.25%胰蛋白酶(含有 0.2% EDTA)常规消化后，1∶3 传代接种到新的细胞培养皿中持续体外扩增培养。

人脂肪间充质干细胞形态及鉴定

人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长

1.细胞表面标记：CD44, CD73，CD90，CD105

2.成脂，成骨分化能力