L929小鼠成纤维细胞简介,培养常见问题及应用

l929细胞的简介

L929，小鼠结缔组织L细胞株929克隆，又名NCTC clone 929，是细胞系L的克隆细胞株。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，取自一只100日龄的雄性C3H/An小鼠乳晕的正常皮下疏松结缔组织和脂肪组织。

L929是其最早的克隆株，建立于1948年三月，选取第95代的细胞系L使用毛细管法分离单细胞建立起来的。经检测L929细胞鼠痘病毒呈阴性，对水泡性口炎和脑心肌炎病毒易感，在免疫抑制鼠体内可成瘤，常用于细胞毒性研究，同时也是个合适的转染宿主。

L929细胞成纤维细胞样，贴壁生长，常用于测定肿瘤坏死因子TNF-α和TNF-β。用TNF处理可引发细胞凋亡和细胞死亡，因此L929细胞经常用于免疫学测定。

L929细胞产品信息

细胞名称：L929，小鼠成纤维细胞

细胞别称：NCTC 929; NCTC-929; NCTC929; NCTC-929L; L cell; L cells; L-cell; L-cells; L cell line; L; Strain L-929; L-929; L 929; L929; L929(NCTC); Clone 929; Earles's cells; Earle's L cells

种属来源：小鼠，雄；100日龄

组织来源：皮下结缔组织

形态特征：成纤维细胞样，贴壁生长

倍增时间：~28-36 hours

培养基：90%MEM+10%FBS+PS

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

传代方法：1:2至1:3，每周 3次

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

保藏机构：ATCC; CCL-1 ATCC; CRL-6364 BCRC; 60091 BCRJ; 0188 DSMZ; ACC-2 ECACC; 85011425 ECACC; 85103115 ECACC; 88102702

致癌性：Yes, in immunosuppressed mice.

L929成纤维细胞形态

l929细胞培养培养方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：MEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

L929细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLL929小鼠成纤维细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀L929小鼠成纤维细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查L929小鼠成纤维细胞密度。

L929小鼠成纤维细胞传代操作步骤

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿L929小鼠成纤维细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

4)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

5)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，L929小鼠成纤维细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

6)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对L929细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

7)将装有L929小鼠成纤维细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

8) 确定L929小鼠成纤维细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

L929小鼠成纤维细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出L929小鼠成纤维细胞，在显微镜下观察L929细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

L929小鼠成纤维细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

L929小鼠成纤维细胞培养常见问题

1.L929小鼠成纤维细胞复苏之后活率不高怎么处理?

L929细胞复苏后需要一定时间恢复状态。复苏活率较低，但不影响细胞生长。

2.L929小鼠成纤维细胞消化时间多久?

L929细胞贴壁较牢，传代时建议1:2传代，37℃培养箱消化3min，胰酶吹落后，再用完全培养液终止。

3.L929小鼠成纤维细胞形态不对，传代之后大部分是圆形，梭形的细胞很少?

L929细胞形态展开较慢，贴壁四十八小时后展开形态会较多。

4.L929细胞可以存放到到-80冰箱吗，还是需要放液氮罐?

L929细胞对冻存条件要求较高，建议程序降温后，及时移入液氮保存。

小鼠成纤维L929细胞应用

L929细胞的应用包括研究不同浓度D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929增殖和凋亡的影响。这些特性使得L929细胞成为生物学和医学研究中常用的细胞模型之一，特别是在研究细胞增殖、凋亡以及药物对细胞影响等方面。

L929细胞为小鼠成纤维细胞，来源于小鼠结缔组织，常用于生物医学研究中的不同领域，主要包括病毒研究、抗肿瘤药物测试、细胞生物学研究、细胞毒性测试和免疫学研究，具体如下：

1.病毒研究

L929细胞常被用于检测和研究各种病毒，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒和疱疹病毒等。L929细胞可以用于病毒复制、扩增和病毒感染的研究。

2.抗肿瘤药物测试

L929细胞可以用于评估抗肿瘤药物的活性。通过将抗癌药物与这些细胞共培养，可以测定药物对细胞生长和增殖的影响，以评估其抗肿瘤潜力。

3.细胞生物学研究

L929细胞在细胞生物学研究中广泛使用，特别是在涉及细胞增殖、凋亡、分化和信号转导等方面。L929细胞可用于研究细胞周期、蛋白质表达、基因调控和细胞内信号传导等生物学过程。

4.细胞毒性测试

L929细胞可以用于评估不同化合物、药物或化学物质对细胞的毒性。这种细胞毒性测试有助于确定某种物质对细胞的安全性，特别是在新药物或化学品的开发中。

5.免疫学研究

L929细胞可以用于研究免疫调节、细胞因子产生和免疫应答。L929细胞可以作为免疫细胞的模型，用于模拟和研究免疫反应。