大鼠成骨细胞 (Osteoblasts) 分离培养

背景简介

大鼠成骨细胞分离自颅骨组织，成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨；破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞培养不仅有助于了解骨形成机制、骨骼系统疾病的分子和细胞学基础，也是药物筛选、生物材料开发和生物工程研究的重要手段。

细胞形态

细胞特点

1. 形态

成骨细胞通常呈扁平的多角形状。它们的细胞体积较大胞质丰富，有丰富的内质网和高度发达的内质网。成骨细胞的胞质中含有大量的线粒体和内质网，这些细胞器对于合成和分泌骨基质起到重要的作成骨细胞在骨形成过程中起到了关键的作用。当骨基质用。

2. 细胞分布

成骨细胞主要分布在骨组织的骨膜和骨骼表面。它们通常与其他细胞形成复合结构，如成骨细胞与骨母细胞和骨基质形成的骨小梁。成骨细胞与骨吸收细胞(如破骨细胞)密切相关，通过相互作用维持骨骼的平衡。

3. 分泌功能

成骨细胞具有高度的分泌功能，能够产生和分泌多种细胞外基质分子，如胶原蛋白、骨基质糖蛋白和骨钙素等。这些分泌物是构成骨基质的重要组成部分，对于维持骨骼的结构和功能起着重要的作用。

4. 钙沉积

成骨细胞在骨形成过程中起到了关键的作用。当骨基质被合成和分泌后，成骨细胞通过细胞膜上的钙通道将钙离子从细胞外输送到细胞内，并将其沉积在骨基质中，使骨组织逐渐形成。这个过程被称为钙沉积，是骨形成的重要步骤。

5.骨吸收调节

除了参与骨形成过程外，成骨细胞还具有调节骨吸收的功能。它们能够感知和响应骨骼的力学刺激和生化刺激，通过调节骨吸收细胞的活性和数量，维持骨骼的平衡。当骨骼受到外界刺激时，成骨细胞能够释放一些因子，抑制骨吸收细胞的活性，减少骨骼的破坏。

材料准备

仪器

离心机、显微镜、计数器、水浴锅、恒温培养箱。

试剂

成骨细胞专用消化液Ⅰ、成骨细胞专用消化液Ⅱ、PBS磷酸缓冲液、成骨细胞完全培养基

耗材

TC处理的培养皿、培养瓶、T75培养瓶、枪头、离心管、细胞筛、移液管

操作步骤

1.取2-3天新生鼠，并用70%乙醇消毒。将新生放入一个大培养皿中。

2.用大剪刀取下头部，抓住颈背处的头部，沿着颅底做一个小切口。使用镊子和镊子小心地从头骨上去除皮肤和脑组织。

3.切掉下颌，刮掉颅骨边缘周围的任何多余的组织和软骨。

4.将颅骨切成两半，放入平底5毫升管中； 用PBS清洗。

5.将头盖骨在成骨细胞专用消化液Ⅰ中消化，37°C孵育10分钟。取出并吸弃胰蛋白酶溶液; 成骨细胞完全培养基中洗涤(血清和钙将使任何残留的胰蛋白酶失活)。

6.在成骨细胞专用消化液Ⅰ中消化，37°C孵育30分钟。

7.取出成骨细胞专用消化液Ⅱ，吸弃，换成新鲜的溶液在37°C下再溶液60分钟。

8.保留最终消化物并转移到15ml离心管中。用成骨细胞完全培养基洗涤颅骨，将溶液转移到含有最终消化物的15ml管中

9.在室温下以1500×g离心细胞溶液5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于成骨细胞完全培养基中。合并细胞悬液。

10.将20 mL 成骨细胞完全培养基加入2×75cm2培养瓶中;向每个培养瓶中加入1ml细胞悬液。

11.将培养瓶在 37°C/ 5% CO2 培养箱培养，直到细胞达到汇合。

染色鉴定图(大鼠成骨细胞示例)

茜素红染色

ALP染色

骨的形态

骨是人体重要的器官，起着支撑移动保护等作用。根据形状，可将骨分为四类：长骨，短骨，扁骨，不规则骨。以长骨为例，长骨分为两个主要区域：骨干和骨骺，骨骺与骨干连接处称为干骺端。

骨细胞的分类

骨细胞分为四类，成骨细胞，骨细胞，祖细胞，破骨细胞。其中破骨细胞来源各种干细胞，干细胞分化为巨噬细胞进一步分化为破骨细胞。而祖细胞分化为前成骨细胞，再分化为成熟的成骨细胞，最后分化为骨细胞。那么几种细胞间如何发生相互影响作用呢?

成熟的骨又是怎么生成的呢?骨的发生有俩种方式。分别为膜内化骨和软骨内化骨。

膜内化骨

膜内化骨主要发生于部分顶骨、颅底、面骨、锁骨等，其过程是间充质细胞直接分化为成骨细胞，成骨细胞产生骨基质并被包埋于基质中逐渐转化为骨细胞。

1. 间充质细胞分化为成骨细胞，骨化中心形成。

2. 分泌类骨质包裹成骨细胞，分化为骨细胞。

3. 小梁基质和骨膜形式。

4. 致密骨向小梁骨浅表发展，拥挤的血管凝结成红色骨髓。

软骨内化骨

骨骼是通过替换透明软骨发育而来。软骨作为模板被新骨完全取代。软骨内骨化比膜内骨化需要更长的时间。颅底的骨骼和长骨通过软骨内骨化形成。

1. 原发骨化中心，骨领出现。

2. 血管长入，成骨细胞逐渐替代软骨细胞。

3.继发骨化点出现，同时髓腔扩大。

4.骨骺线出现，形成骨骼。

骨折分类

当发生骨折时，无论有无及时的紧急救治，最终都会发生愈合。骨折有多种分类。根据有无暴露于组织外分为开放性骨折和闭合性骨折。

骨折修复

1. 破裂的血管渗出血液，凝结成骨折血肿。

2. 软骨细胞与成骨细胞形成内部和外部愈合组织。

3. 软骨内骨化逐渐被小梁骨取代。

4. 重塑用成熟骨代替未成熟的骨。