RAW 264.7细胞培养注意事项和常见问题

RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞取材于Abelson小鼠白血病病毒诱发的肿瘤组织，是科研上常用的炎症细胞模型之一。RAW 264.7细胞系是合适的转染宿主。细胞将胞饮中性红并吞噬乳胶珠和酵母聚糖。它们能够依赖抗体对绵羊红细胞和肿瘤细胞靶标进行裂解。LPS 或 PPD 治疗2天会刺激红细胞裂解，但不会刺激肿瘤细胞靶标。

RAW 264.7细胞培养注意事项和常见问题

RAW 264.7细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面

RAW 264.7细胞培养所需试剂物品

培养基：DMEM+10%FBS+PS、培养皿、无血清冻存液等

培养条件气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

RAW 264.7细胞复苏操作

a、将含有1mLRAW 264.7细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。

b、在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。

c、然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜)。第三天换液并检查细胞密度。

RAW 264.7细胞传代处理

传代密度：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

传代：1:2至1:3 每周3次

RAW 264.7细胞传代实验步骤

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次。

b、加2 mL预冷的PBS溶液于培养瓶中，使PBS溶液浸润所有RAW 264.7细胞，然后轻轻吹下细胞，将吹下来的细胞及细胞悬液收集到无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将RAW 264.7细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

RAW 264.7细胞冻存处理

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

RAW 264.7细胞冻存实验步骤

a、收集RAW 264.7细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据RAW 264.7细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

RAW 264.7细胞培养注意事项

1.运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。

2.收到细胞后第一次传代建议1：2传代，1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

3.由于RAW264.7细胞易有不同形态，传代时就会发现形态变为梭形的细胞很难消化下来，轻敲培养皿细胞不会脱落，用力吹打又容易对细胞产生较大损伤，因此要尽量避免细胞发生形态改变。即在接种细胞时保持一个适中的传代密度，避免其向终末细胞分化，因为一旦细胞发生分化变为长形是无法恢复的，这是培养RAW264.7细胞时最需要注意的问题。

4.RAW264.7细胞喜欢连片生长，正常状态下应该是一小片一小片的分布在培养皿中，片片之间不相连接，等到长到更多更密的时才会连成大片，但同时也会叠加成层，容易出现部分细胞飘起无法贴壁的问题。所以，要关注好细胞的汇合程度，控制好细胞的生长速度，不能等到叠加成层时才去传代。

5.RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时左右绝大部分细胞就能够贴下去，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于培养皿中。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是在提醒你注意传代了，此时无论汇合度如何都需要进行传代了，因为形态发生改变的细胞对实验结果会产生较大影响，最终造成实验数据不理想。

RAW 264.7细胞培养常见问题

在培养RAW264.7细胞的过程中容易遇到的问题主要包括以下几种：

1. 复苏后存活率不高

2. 细胞形态发生变异

3. 不同形态细胞消化时间不等

4. 细胞生长速度缓慢

当你遇到类似问题时，可尝试以下几种解决方案。

1. RAW264.7细胞复苏后存活率不高

原因： RAW264.7细胞不同生长密度下细胞形态不同，若复苏密度太高，细胞增殖过快，会加剧细胞的营养缺失，加速细胞老化;若复苏密度太低，细胞生长缓慢。

解决办法： 直径10cm的培养皿复苏细胞，细胞数量控制在1.0×106~1.5×106个

2. RAW264.7细胞形态发生变异

原因： RAW264.7细胞的培养环境恶劣或吞噬过多抗原后会促使该细胞呈现梭形、长梭形，形态发生变化。

解决办法： 改善细胞培养环境，例如与细胞接触的器皿保证无菌，使用质量较高的胎牛血清。

3. RAW264.7细胞不同形态细胞消化时间不等

原因： 细胞老化后，形态发生变化，细胞伪足变得多且长，这使得这种形态的细胞变得较难消化，使用胰酶长时间消化又会对细胞产生较大损伤。

解决办法： 可在正常时间终止消化，收集大部分正常状态的细胞，再加入新的胰酶继续消化，而伪足过多过长的细胞，即使加胰酶消化10min及以上也是难以消化下来的，勉强消化下来，对后续的实验数据也会产生较大影响，即没必要每次传代都收集全部细胞，已经发生分化的细胞无需保留要及时丢弃。

4. RAW264.7细胞生长速度缓慢

原因： 传代时汇合度过低会导致细胞生长缓慢，甚至难以贴壁，或是细胞发生了支原体污染。

解决办法： 定期传代，控制好传代比例，汇合度不可过低。及时进行支原体检测，如发现污染，即刻使用支原体去除试剂进行清除。

5.RAW 264.7收到货，细胞不见

RAW 264.7收到货，细胞不见这是因为RAW 264.7 细胞贴壁较松，快递运输路上受到颠簸，可能会脱落。脱落的细胞悬浮在培养基中不容易聚焦。可以把细胞放进培养箱静置2-4个小时就可以看到了。

如果静置后看到的细胞仍偏少，请将瓶子里的培养基都转移到离心管里，1200rpm(约250g)离心3分钟，即可看到沉淀的细胞。

6.RAW 264.7细胞不贴壁怎么办

RAW 264.7细胞不贴壁怎么办将RAW 264.7细胞离心收集，用新鲜的培养基重悬细胞放到新的培养瓶里之后，可能会出现细胞成团漂浮、不贴壁的情况。这种情况下，把细胞离心收集，用1mL培养基重悬，慢慢地，轻轻地吹打，直到细胞被吹成单细胞，就可以重新铺板了。

RAW 264.7脱落后倾向于抱团，抱团时细胞是活着的，但很难贴壁。记得一定要把聚成团的细胞吹散成单细胞，不然细胞很难重新贴壁。

7.RAW 264.7细胞形态是怎样

RAW 264.7细胞形态是怎样RAW 264.7细胞被指定为粘附线并像单层一样处理，但是培养物可以混合粘附和悬浮种群。

在培养RAW 264.7的初始阶段，细胞附着并呈长方体状，并带有细长的延伸部分。随着培养物变得更加密集，可能会有另一层圆形细胞附着在原始单层上。在极重的培养物中，细胞会释放到培养基中。在重培养中，通常有附着细胞和悬浮细胞。

8.RAW 264.7细胞分化处理

RAW 264.7细胞分化处理AW 264.7细胞培养过程中密度过大，培养基颜色发黄都易刺激细胞分化，分化的RA264.7细胞呈多角形，体积明显增大，时常有较长的黑色触角。

RAW 264.7细胞如何避免细胞分化

RAW 264.7细胞消化时不能用胰酶消化，消化会造成细胞分化，客户可以用移液枪吹打，会比巴氏吸管方便一点。

RAW 264.7细胞分化处理

前面我们说到RAW 264.7不能用胰酶消化，许多实验室用细胞刮传代，这是一种非常经典好用的方法。在这边我们推荐“吹打传代”方法，其操作步骤简单，也能更好地控制细胞分化率。

(一)吹打传代操作步骤

1.轻拍几下培养皿

2.用1ml 的枪或者巴氏管把细胞吹下来

3.细胞吹下来后转移到15ml离心管

4.1200rpm(约250g)离心3min

5.去上清，用新鲜培养基重悬细胞

6.按比例接种到新的培养皿中

(二)吹打传代时机

1.当细胞密度较低的时候，可能不太好吹下来。

2.当细胞密度达到80%~90%的时候，最容易吹下。

(三)操作注意事项

1.RAW 264.7细胞三天不传代更容易分化，很难吹下，每一次接种密度都要控制好;

2.分化的细胞贴壁牢固，传代的时候请勿强制性吹下这些细胞，只接种容易吹下的那些未分化细胞;

3.吹打的力度一定要轻，切勿暴力吹打;

4.细胞的贴壁性和培养器皿的材料也有关，有时RAW 264.7 会出现太容易吹下的情况，连分化细胞都贴壁较松，此时更适宜用巴氏管吹打;

5.培养时，无法保证100% 不分化，通过传代可以将分化比例控制在一定范围。