小鼠皮层神经元细胞分离培养方法视频教程

小鼠皮层神经元细胞背景简介

小皮层神经元细胞分离自脑皮层组织;皮层神经元细胞是构成中枢神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突触(轴突)的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4-120微米。核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质，还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。皮质神经元是大脑皮质的主要组成细胞之一，是大脑进行功能活动调节的基本单位，参与动物多种中枢神经系统疾病的病理过程。通过形态学观察显示神经元从贴壁、伸出突起开始;突起逐渐增多，而后突起进一步增多并逐渐成网，同时细胞胞体增大，周边光晕明显。10-12d细胞最为丰满，随后神经元开始裂解，突起逐渐减少，细胞已退化变性，轮廓模糊，光晕消失，细胞变形。

小鼠皮层神经元细胞分离培养所需试剂

小鼠皮层神经元细胞贴壁培养基、小鼠皮层神经元细胞完全培养基、小鼠皮层神经元细胞基础培养基、小鼠皮层神经元细胞添加剂、皮层神经元细胞组织分离液 、冰盘、HBSS缓冲液、胰酶、配好的dmem(500ml dmem+50ml 胎牛血清+5ml双抗)

小鼠皮层神经元细胞分离培养所需耗材

尖头镊、弯镊、剪刀、10 cm培养皿、6 cm培养皿、70um细胞筛、台盼蓝、计数板

小鼠皮层神经元细胞分离方法

提前开启紫外线照射超净台30 分钟。将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 分钟。紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上。

包板：将10x的多聚赖氨酸(PLL)稀释成1x的工作液，每个六孔板加入2mL晃动，铺满底部。过夜，洗2-3次。

(消化前的步骤在冰盘上操作)

1. 准备试剂：准备5个10 cm培养皿，5个6 cm培养皿置于冰上，倒入HBSS

2. 取胎鼠：取E17.5天(14.5-17.5天 大了会有胶质细胞)的孕鼠，处死后酒精消毒孕鼠，用手术剪剪开孕鼠腹部，将子宫取出，放入10 cm培养皿。

3. 洗子宫：将取出的子宫在剩余10 cm培养皿中洗3-4次，将胎鼠取出放入另一个10 cm培养皿。

4. 取脑子：用尖头镊剥离胎鼠头部及脑壳，取出脑子黑色画圈部分，放入6 cm培养皿

5. 剥脑膜：将一个脑移至一个新的6 cm培养皿(两三个脑子用一个6 cm培养皿，防止太久HBSS升温)，在解剖镜下去除嗅球(绿色的部分)，小脑及两个大脑半球中间的连接物，将剥干净的皮层放入新的6 cm培养皿

6. 消化：全部剥完后，吸走HBSS，用镊子夹碎脑袋，夹至浆糊状，每个脑子加入1ml皮层神经元细胞组织分离液，五个脑子一组，吹打均匀后，放入10 cm培养皿中，37℃消化12min(避免一个10 cm培养皿放入太多脑子，避免离心管消化，会导致消化不均匀)

7. 终止消化：立即加入等量的配好的贴壁培养基终止消化，用5mL枪头吹打12下

8. 过筛：将终止消化后的溶液，用细胞筛过滤

9. 重悬：1000G离心5min，去除上清，以每个脑子加入1ml配好的贴壁培养基，重悬。

10. 计数：吹打均匀后，取10ul细胞稀释液，10ul 0.4%台盼蓝染色，混匀，计数

11. 种板：每个六孔板，每孔1.0-1.2*10^6个，12孔板每孔5-6*10^5个，10 cm培养皿1.2-1.5*10^7

培养皿规格种板细胞量

十二孔板：5-6*10^5个/孔

六孔板：1.0-1.2*10^6个/孔

10 cm培养皿：1.2-1.5*10^7

12. 换液：种板4小时左右换液，此时用配好的神经元专用培养基

13. 培养：每3天换一次液。

小鼠皮层神经元细胞鉴定

1. 形态观察

皮层神经元细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈神经元细胞样，细胞属于终末分化细胞;属于不增殖细胞群;

2. 标志物鉴定

皮层神经元细胞经β-Tubulin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。

3. 诱导实验