第一节:小鼠小肠类器官原代分离培养教程

一、准备工作

1. 将IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)，稀释好的IMMOCELL Antibacterial detergent stock和IMMOCELL MLDT-Target digestive solutions(专用消化液)于4度预冷2小时以上，将1ml无菌枪头和200ul无菌枪头封口后于-20度预冷12小时以上。

2.将IMMOCELL MLDT organoid conditioned mediumm(MLDT-条件培养基)，MLDT organoid supplement A(10X MLDT-补充剂A)，MLDT organoid supplement B(200XMLDT-补充剂B)和Specialized buffers(PH缓冲液)于常温化冻后，配制成完全培养基，4℃保存。

3. 将10cm精细手术剪，12cm精细手术镊子，15cm常规平头镊子和3号手术到高温高压灭菌后，和提前准备好的碎冰1000g于紫外下消杀30min。

二、小肠组织获取

1.小鼠脱臼处死后，浸在75%乙醇中2分钟，后续将小鼠拿进无菌生物安全柜中继续操作，后续所有用到物品均经过灭菌处理。

2.解剖小鼠，将小鼠小肠取出，取适量长度的小肠段10 cm左右，用稀释好且4度预冷的IMMOCELL Antibacterial detergent stock浸泡，将小肠剪为1cm左右的组织块，仔细将小肠外的肠系膜去除。去除肠系膜后纵向剪开小肠肠壁，用IMMOCELL Antibacterial detergent stock清洗3遍以上去除内容物(组织所接触到的环境均为冰上或4 ℃的环境)。

三、小肠隐窝分离

1.将三号手术刀和配套刀片在安全柜内组装后，用刀背轻轻刮除小肠内壁的绒毛，尽量不要破坏其结果的完整性，刮除后用IMMOCELL Antibacterial detergent stock清洗2遍.

2.将处理好的干净组织挑取到10cm无菌培养皿中，倒入少量IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基),用无菌的10cm精细剪刀将组织切成糜状后，收集于用抗粘附剂润洗过的50ml离心管，加入20mlIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)，用抗粘附剂润洗过的10ml离心管吹打20次，待沉降后去除上清液，再加入同体积的IMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)清洗两次(无需吹打).

3.清洗后去除上清，注意不要损失组织块，用DPBS去除培养基残留后，用10-12ml预冷的IMMOCELL MLDT-Target digestive solutions(专用消化液)重悬组织，转移到15ml离心管中。做好标记，备注小鼠品系，器官名称和日期等，封口膜封好置于4度环境下的垂直混匀仪中等转速消化45-60min。

4.消化结束后，冰上等组织沉降，吸去上清液再加入10-12mllIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)，然后用10 mL的枪进行吹吸20次，此时会看到溶液变浑浊，可以吸取少量进行镜检，观察溶液内隐窝的数量和完整度。

5.冰上静置1分钟，待组织沉降后，将上清过70 μM的细胞筛，收集过滤物，过滤物即为隐窝。(可多次用llIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)冲洗细胞筛上的组织获得更多隐窝).

6.将收集的隐窝溶液用600 g离心10分钟后去除上清，再加入1mlllIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)重悬沉淀物到1.5ml离心管中，100 g离心2分钟，弃去上清，加1 mL llIMMOCELL Reactive detergent(活性保持培养基)，轻弹管壁重悬重复两次，弃去上清后，视隐窝量加300-500 μL的完全培养基，轻弹管壁重悬。

四、注意事项

1.所有离心管，移液管都要用抗粘附剂润洗避免组织黏附在其上;

2.所有组织为保持其活性都应该在4度环境中保持，试剂用完后尽量插入冰上保持温度;

3.最后一次重悬1.5ml后的细胞沉淀重悬不可吹打，通过敲打离心管重悬。