第三节:人脐静脉内皮细胞原代分离,鉴定及培养

细胞简介

人脐静脉内皮细胞分离自脐带组织，它是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构，脐带中通过尿膜的血管即脐动脉和脐静脉，卵黄囊的血管即脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。在子宫中，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管，与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行CO2和O2，代谢产物即代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿

细胞特点

原代人脐静脉内皮细胞具有很好的增殖能力和分化能力，能够分化为多个不同的细胞类型，例如成血管内皮细胞、平滑肌细胞等。此外，原代人脐静脉内皮细胞表达的受体和分泌的因子广泛参与了许多重要的体内生理过程，例如血管形成、血液循环调节、血小板聚集等。这也使得原代人脐静脉内皮细胞在治疗许多疾病时显示出了广泛的应用价值。

人脐静脉内皮细胞原代分离，鉴定及培养

材料准备

试剂：PBS，胰酶，ECM完全培养基，HUVEC专用消化酶，脐带运输保存液

器械：注射器，手术钳，T25培养瓶，玻璃大皿，灌胃针

操作流程

实验准备

提前将使用手术钳，灌胃针及玻璃大皿高温灭菌，准备所需要的分离试剂。

1.将 15-20 cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液(添加双抗和肝素钠)中储存。(注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过 6 小时，否则废弃)

2. 使用50ml注射器，每次可以灌满新鲜PBS后可以用止血钳夹住脐带两端，轻缓揉捏，将脐带内的血块化开，方便冲洗干净。

3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入 15 mL (灌满为标准)的HUVEC专用消化酶，室温下消化 15-20分钟，有条件的话放置到37摄氏度的环境中，消化期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。

4. 消化完后，先用钝头针头疏通下端流出口，防止阻塞，将下端手术钳松开，消化液流入一个 50 mL 无菌离心管中，管内要有部分全培养基，或者纯血清，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带2-3次，每次都要用手轻微揉动。

5. 将收集液，置于离心机1000 rpm 离心3分钟。

6. 倒去上清，加入 10 mL ECM培养基，用巴氏管吹散细胞，将所有液体转入T25培养瓶中，37℃培养。

7. 培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的 PBS 溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 mL新鲜的ECM培养基。

8. 以后每2天换一次培养基(每次换掉 2/3 的培养基)。

9. 一般培养5-7天，细胞可长满至 80-90%单层，这时可以传代。

细胞传代

1. 倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2- 3 mL 消化液(0.25% 胰酶+0.1% EDTA)消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

2. 用巴氏管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个 50 mL无菌离心管中，置于离心机1000 rpm离心 3 分钟。

3. 倒掉上清，加入 10 mL新鲜培基，一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶，以后照此传代培养。

4. 一般传代 2-3 代(培养了 20 天左右)用于做各种实验效果最好。P6代以内实验结果收到认可。

细胞鉴定

1. 形态学观察

细胞贴壁生长，呈短梭形或铺路石样向前排列，上皮细胞样。

2. 标记物检测

一般的标准为VWF,CD31,VIMTENMIN为阳性(>95%)

3. 诱导实验

成管实验

HUVEC细胞标志物荧光鉴定

HUVEC成管实验