第一节:大鼠小鼠脂肪干细胞原代分离/培养及鉴定

背景介绍

脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs，其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。

细胞形态

小鼠脂肪干细胞形态

细胞特点

1、具有自我更新及多向分化的潜能

2、来源充足

3、对供区的创伤较小

4、获得率及体外扩增速率高

材料准备

脂肪干细胞专用培养基

PBS溶液(IMC-401)

0.25%胰蛋白酶细胞消化液 (IMC-501)

I型胶原酶溶液 (1 mg/mL)

实验步骤

1. 3天龄到4周龄(推荐周龄小)大鼠或小鼠1只，麻醉处死，75%乙醇浸泡消毒3-5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤，暴露腹股沟脂肪垫。

2. 钝性剥离脂肪组织，清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎，转移至15 mL离心管中。

3.加入3-4倍体积的0.1%(1 mg/ml) I型胶原酶溶液，37℃水浴振荡约20 min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织，辅助消化。

4.250×g，4℃，离心10min。注意离心机预冷至4℃。

5.小心吸去上层油脂，注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基，重悬沉淀，过40μM细胞筛到新的离心管中，再次离心10min。

6.重复洗涤一次，吸去上清。

7.加入8 mL完全培养基重悬沉淀，转移至培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱中。

8.待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。

9.换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。

10.以后每两天更换一次培养基，细胞汇合达80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次传代。

注意事项

1. 全程无菌操作，小鼠要提前酒精浸泡防止污染，仔细剥离去除血管和筋膜组织。

2. 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨，以免破坏细胞。

3. 小鼠皮下脂肪前体细胞随着小鼠周龄增大，诱导分化潜能逐渐下降，故建议选择4周内小鼠进行实验。

4. 剪开皮肤的剪刀需与取材的剪刀相区分，避免污染。

5. 需要的胶原酶量和消化时间需要根据具体情况相应增减。如果消化已经完全，未见明显组织则可停⽌消化。

6. 消化完后的组织在离心前把离心机预冷，脂肪原代细胞在低温既可保持良好的活力，又能便于细胞更好的与油脂分离。

大鼠小鼠脂肪干细胞鉴定

1. 形态学观察

原代培养后，传代2-3次，ADSCs呈现单层，梭状或多枝状的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞，贴壁较牢固。

2. 标记物检测

一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性(>90%);CD34、CD45、CD11b为阴性(<5%)。

3. 诱导分化实验

在特定的诱导条件下，脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。

不同代系免疫表型

三系分化鉴定