第四节:hESC细胞传代教程

第四节：hESC细胞传代教程 

本视频为厦门逸漠生物科技有限公司出品关于hESC细胞培养教程之：hESC细胞传代，我们对每一步操作都做了演示，以便科研老师更好地理解hESC细胞传代实验过程。

hESC细胞培养教程之：hESC细胞传代

一.传代条件

细胞满足以下条件之一，即需要进行细胞传代：

1. 细胞汇合度达85%左右，移动视野观察细胞生长状态，整个皿密度均匀，没有过大的克隆或者克隆过于致密的部分，一般皿中心部分比边缘密度略大;一般情况下每4天传代一次，即使克隆团较小，汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天；

2. 细胞汇合度较低，但干细胞集落过大，中央细胞生长不良；

二.传代间隔和比例

1. 可根据细胞生长状态和实验需求按1:5~1:20的比列进行传代；

2. 如果细胞正常，克隆汇合度85%, 大小均匀，建议按照1:10进行传代；

3. 如果密度偏低，则可降低传代比例，密度偏高，则增加传代比例。

三.准备工作

1. 提前30 min将Immocell hESC完全培养基，Immocell Y-27632（10 mM）和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中，恢复至室温；

2.吸取4 mL hESC完全培养基加入到离心管中，按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632（10 mM），充分混匀，恢复至室温；

四.hESC细胞传代步骤

1. 从培养箱中取出待传代细胞，吸弃孔内的hESC培养基，加入2 mL/孔的DPBS，轻轻摇晃并吸弃，再加入2 mL/孔的Immocell EDTA传代工作液（0.5 mM）,使溶液完全覆盖孔底，将培养板置于细胞培养箱中；

注意：保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触了，使其受热均匀，不要叠放，设定消化时间10 min；

2. 吸弃6孔板中1孔的Matrigel包被液，加入预温的 Y-27632+hESC完全培养基2 mL/孔在6孔板上做好标记（细胞名称，代次，传代比例，日期和操作人）；

3. 消化结束后，从培养箱中取出消化的细胞，显微镜下观察细胞的变化，大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；

4. 将消化好的细胞培养板拿回生物安全柜中，避免震荡摇晃细胞，倾斜吸弃Immocell EDTA传代工作液，加入2 mL/孔预温的Y-27632+hESC完全培养基，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质；

5.可轻柔吹打细胞1-2次；不能超过2次，避免将细胞吹打成单细胞状态，注意避免刮擦细胞，有部分细胞（10-15%）未脱离基质是正常，若有大量未脱离则需延长消化时间；

6.一次操作不要超过1个6孔板，当hESC培养基加入后要快速吸出。因为EDTA传代工作效果在hESC培养基加入后会很快被终止，在hESC培养基加入后细胞又会很快贴壁，而hESC培养基不能长时间处于EDTA传代工作液（<15min），所以收集接种细胞时操作必须快速。